Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core
Summary
Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.
Abstract
A detecção de fluorescência fornece a base para muitas técnicas de microscopia amplamente utilizados e rápido avanço empregados em aplicações biológicas e médicas modernas. Forças de fluorescência incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo. Infelizmente, as formas convencionais de microscopia de fluorescência sofrem de uma grande fraqueza, a resolução de difração limitada no plano de imagem, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, essa limitação foi superada com a introdução de técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, como a microscopia localização fotoativados (PALM). Ao contrário de suas contrapartes convencionais, PALM pode produzir imagens com uma resolução lateral de dezenas de nanômetros. É, portanto, agora possível a utilização de fluorescência, com os seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis da estrutura celular e organização.
_content "> Infelizmente, PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Neste artigo, vamos mostrar como implementar estudos PALM uma única cor de estruturas vesiculares, em neurônios cultivados fixos. PALM é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm. As principais etapas da nossa abordagem incluem a rotulagem de neurônios com photoconvertible (verde para vermelho) quimeras de carga vesícula, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia super-resolução e processamento de imagens RAW para produzir imagem PALM de alta resolução. Nós também demonstrar a eficácia da nossa abordagem, apresentando imagens excepcionalmente bem-resolvidos de vesículas densa-core (DCVS) em neurônios do hipocampo em cultura, que refutam a hipótese de que o tráfico de DCV são extrasynaptic é mediado em grande parte por grupos DCV.Introduction
Um número de processos celulares dependem de tráfico de vesículas mediada preciso e eficiente de biomoléculas a destinos específicos subcelulares. Um exemplo proeminente é a montagem sináptica, que é precedida de longo alcance, a entrega mediada por vesículas sinápticas de eleitores a partir de sites de biogênese na soma neuronal para pré e pós-sinápticos locais potencialmente distais 1.
A microscopia de fluorescência é um método poderoso e popular de estudar tráfico vesícula. Pontos fortes da técnica incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo 2. Infelizmente, até há relativamente pouco tempo, a técnica tem sofrido com uma grande fraqueza, resolução de difração limitada 2, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, a resolução lateral em microscopia de fluorescência ultrapassou a barreira de difração com a introdução de super-resolução mi de fluorescênciatécnicas croscopy, como PALM 3. A resolução lateral do PALM, dezenas de nanômetros, é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm 4. Assim, é agora possível a utilização de fluorescência, com seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis de vesículas, incluindo alguns aspectos de seu tráfico para sites subcelulares específicos.
PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Aqui nós descrevemos como implementar estudos palma da estruturas vesiculares, e demonstrar a eficácia da nossa abordagem para o caso de as DCV são em neurônios do hipocampo. Em particular, podemos usar PALM para tratar a hipótese de que o tráfico de DCV são de sinapses em neurónios do hipocampo é mediada por grupos DCV 5-8.
Tráfico mediada pelo Cluster de vesículas de sinapses no desenvolvimento de neurons é uma possibilidade intrigante, pois pode facilitar a rápida estabilização sináptica e montagem 9,10. Os defensores do tráfico em cluster do DCV são citar o grande tamanho aparente de puncta fluorescente extrasynaptic abrigar carga DCV exógena como provas agrupamento 6. No entanto, estes pontos lacrimais aparecem em imagens geradas utilizando técnicas de microscopia de fluorescência limitada de difração, que não são adequados para os efeitos do tamanho de distinção decorrentes da difracção dos que resultem do agrupamento.
Para resolver esse problema, foram coletadas fluorescência widefield convencional e imagens palma da neurônios que expressam quimeras direcionados para as DCV são. A análise destas imagens revelaram que> 92% dos clusters DCV extrasynaptic putativos em imagens convencionais são resolvidos como 80 nm (individual porte DCV-) 11 puncta em imagens de palma. Assim, estes dados largamente invalida a hipótese de agrupamento aplicado a DCV são no desenvolvimento hippocaMpal neurônios.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM e técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução relacionados surgiram recentemente como um complemento valioso para as formas mais bem estabelecidos da microscopia óptica e microscopia eletrônica (EM) 22-24. Atributos positivos da PALM incluem a preparação da amostra relativamente simples e mínima perturbação da amostra. Em princípio, PALM também pode ser usado para estudar as células vivas. Provavelmente, o principal atributo negativo da Palm é a aquisição de dados demorad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (para JEL), MH 66179 (com o Dr. Gary Banker da Oregon Health & Science University / OHSU) e P30 NS061800 (o Dr. Sue Aicher de OHSU). Agradecemos Barbara Smoody para amplo suporte com a cultura de neurônios do hipocampo, e as Dras. Brian Long e James Abney para uma leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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