Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel
Summary
Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.
Abstract
Detektion von Fluoreszenz ist die Grundlage für viele weithin genutzt und rasch fort Mikroskopie-Techniken in der modernen biologischen und medizinischen Anwendungen eingesetzt. Stärken der Fluoreszenz sind seine Sensitivität, Spezifität und die Kompatibilität mit Live-Bildgebung. Leider konventionellen Formen der Fluoreszenzmikroskopie leiden an einer großen Schwäche, beugungsbegrenzten Auflösung in der Bildebene, die Untersuchungen von Strukturen mit Abmessungen kleiner als ~ 250 nm behindert. Vor kurzem hat diese Einschränkung mit der Einführung der Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie Techniken, wie photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) überwunden. Anders als ihre konventionellen Pendants, können PALM Bilder mit einer lateralen Auflösung von zehn Nanometern zu erzeugen. So ist es nun möglich, Fluoreszenz zu verwenden, mit seinen unzähligen Stärken, um ein Spektrum von bisher unzugänglichen Attribute der zellulären Struktur und Organisation aufzuklären.
_content "> Leider ist PALM nicht trivial zu implementieren und erfolgreiche Strategien müssen oft auf die Art des untersuchten Systems angepasst werden. In diesem Artikel zeigen wir, wie einfarbige PALM Studien von vesikulären Strukturen in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. PALM ist ideal, um das Studium der Vesikel, die Dimensionen, die typischerweise im Bereich von ~ 50-250 nm. Schlüsselschritte in unserem Ansatz enthalten haben geeignet Kennzeichnung Neuronen mit photoconvertible (grün bis rot) Chimären Vesikel Fracht, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer Super-Resolution-Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, um eine hochauflösende Bild PALM produzieren. Wir haben auch die Wirksamkeit unseres Ansatzes zu demonstrieren indem außergewöhnlich gut aufgelöste Bilder der Dense-Core-Vesikel (dcvs) in kultivierten Hippocampus-Neuronen, die zu widerlegen die Hypothese, dass extrasynaptische Handel dcvs wird weitgehend von DCV-Cluster vermittelt.Introduction
Eine Reihe von zellulären Prozessen abhängig von genauen und effizienten Vesikel vermittelten Handel von Biomolekülen an spezifischen subzellulären Destinationen. Ein prominentes Beispiel ist die synaptische Versammlung, die durch langfris reichten, Vesikel-vermittelte Abgabe der synaptischen Bestandteile von Seiten der Biogenese der neuronalen Soma potenziell distalen prä-und postsynaptischen Websites 1 vorangestellt ist.
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke und beliebte Methode der Untersuchung Vesikeltransport. Stärken der Methode sind seine Sensitivität, Spezifität und die Kompatibilität mit Live-Bildgebung 2. Leider bis vor kurzem die Technik von einer großen Schwäche, beugungsbegrenzten Auflösung 2, die Untersuchungen von Strukturen mit Abmessungen kleiner als ~ 250 nm behindert gelitten. Kürzlich laterale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie übertraf die Beugungsgrenze mit der Einführung der Super-Resolution-Fluoreszenz miMikroskopie-Techniken, wie PALM 3. Die laterale Auflösung von PALM, zehn Nanometern, ist ideal, um das Studium der Vesikel, die Dimensionen, die typischerweise im Bereich von 50 bis 250 nm ~ 4 haben geeignet. So ist es nun möglich, Fluoreszenz zu verwenden, mit seinen unzähligen Stärken, um ein Spektrum von bisher unzugänglichen Attribute von Vesikeln, darunter auch einige Aspekte ihrer Handel auf bestimmte Websites subzellulärer aufzuklären.
PALM ist nicht einfach zu implementieren und erfolgreichsten Strategien müssen oft von der Art des untersuchten Systems zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir, wie man PALM Studien von vesikulären Strukturen zu implementieren, und wir zeigen die Wirksamkeit unseres Ansatzes für den Fall der dcvs in Hippocampus-Neuronen. Insbesondere verwenden wir PALM zu der Hypothese, dass der Menschenhandel zu dcvs Synapsen im Hippocampus-Neuronen-Adresse wird von DCV Cluster 8.5 vermittelt.
Cluster-vermittelte Handel Vesikel an Synapsen in Entwicklungs neurons ist eine faszinierende Möglichkeit, weil es schnelle synaptische Stabilisierung und Montage 9,10 erleichtern. Die Befürworter der Clusterhandel dcvs zitieren die große scheinbare Größe extrasynaptische Fluoreszenz puncta beherbergen exogene DCV Fracht, wie Nachweise für Clustering-6. Allerdings erscheinen diese puncta in Bildern erzeugt unter Verwendung von beugungsbegrenzten Fluoreszenzmikroskopie-Techniken, die nicht zu unterscheidende Größe Wirkungen, die sich aus der Beugung von denen aus Clustering geeignet sind.
Um dieses Problem zu beheben, haben wir für konventionellen Weitfeld-Fluoreszenz und PALM Bilder von Hippocampus-Neuronen, Chimären zu dcvs richtet. Die Analyse dieser Bilder ergab, dass> 92% der vermeintlichen extrasynaptische DCV-Cluster in konventionellen Bildern als 80 nm (Einzel DCV-Größe) 11 puncta in PALM Bildern behoben. Somit sind diese Daten weitgehend zum Erlöschen der Clustering-Hypothese über dcvs in Entwicklungs hippoca angewendetMPAL Neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM und verwandten Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken haben vor kurzem entstanden als eine wertvolle Ergänzung zum besser etablierten Formen der optischen Mikroskopie und Elektronenmikroskopie (EM) 22-24. Positive Attribute PALM sind relativ einfache Probenvorbereitung und minimale Proben Störung. Grundsätzlich PALM auch verwendet werden, um lebende Zellen zu untersuchen. Wahrscheinlich der Haupt negatives Attribut von PALM ist zeitaufwendig Datenerfassung, die erheblich behindert Studien …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt 2 GM061539 R15-02 (BAS), 2 NS40425 R15-03 (zu JEL), MH 66179 (Dr. Gary Banker der Oregon Health & Science University / OHSU) und P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher von OHSU). Wir danken Barbara Smoody für umfangreiche Unterstützung mit der Kultur des Hippocampus-Neuronen und Drs. Brian Long und James Abney für eine kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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