神経高密度コア小胞の超解像イメージング
Summary
我々は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）ベースの固定、培養神経細胞内の小胞の研究を実装する方法について説明します。我々のプロトコルの主要な構成要素は、photoconvertibleキメラで小胞を標識する超解像顕微鏡システムでまばらにサンプリングされた生の画像を収集し、超解像画像を生成するために生の画像を処理挙げられる。
Abstract
蛍光の検出は、現代の生物学的および医学的用途に使用多くの広く利用され、急速に進展顕微鏡技術の基盤を提供します。蛍光の強さは、その感度、特異性、およびライブイメージングとの互換性があります。残念ながら、蛍光顕微鏡の従来の形態は、約250ナノメートルよりも小さな寸法を有する構造の研究を妨げる撮像面における1つの主要な弱点、回折限界分解能、苦しむ。最近では、この制限は、このような光活性化局在化顕微鏡法（PALM）のような超解像蛍光顕微鏡技術の導入により克服された。その従来の対応とは異なり、Palmは数十ナノメートルの横方向の解像度を有する画像を生成することができる。それは、細胞の構造と組織の以前にアクセス不能な属性のスペクトルを解明するために、その無数の強みと、蛍光を使用するようになりましたが可能である。
_content ">残念ながら、Palmは、実装が簡単ではありません、そして成功した戦略は、多くの場合、研究対象のシステムのタイプに合わせて調整する必要があります。この記事では、我々は固定、培養神経細胞内小胞構造の単色ヤシの研究を実装する方法を示しています。 PALMは、理想的には50〜250ナノメートル〜から。我々のアプローチにおける重要なステップが含ま通常、ある範囲の寸法を有し、小胞の研究に適しているとまばらにサンプリングされたRAW画像を集め、photoconvertible（赤と緑）小胞の貨物のキメラで神経細胞を標識し超解像顕微鏡システム、及び高解像度のPALM画像を生成する生の画像を処理する。また反論培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞（DCVS）の非常に良好に解像画像を提示することによって、我々のアプローチの有効性を実証DCVSのシナプス人身売買は、DCVクラスタで主に媒介されるという仮説。Introduction
細胞プロセスの数は、特定の細胞内の宛先への生体分子の正確で効率的な小胞が介在する人身売買に依存しています。一顕著な例は、神経細胞体における生物発生の現場から、潜在的に遠位の前と後シナプスのサイト1へのシナプスの構成成分の長期であった、小胞を介した送達に先行されるシナプスアセンブリである。
蛍光顕微鏡は、小胞輸送を研究する強力かつ一般的な方法です。技術の強みは、感度、特異性、およびライブイメージング2との互換性があります。残念ながら、比較的最近まで、技術は〜250ナノメートルより小さい寸法の構造の研究を妨げる一つの大きな弱点、回折限界分解能2、苦しんでいる。近年、蛍光顕微鏡の横解像度は、超解像蛍光マイルの導入により回折限界を超えパーム3などcroscopy技術。手のひらの横方向の解像度が、数十ナノメートルは、通常、50〜250ナノメートル〜4の範囲に寸法を有する小胞の研究に最適です。これは、特定の細胞内のサイトへの人身売買のいくつかの側面を含む小胞の以前にアクセス不能な属性、のスペクトルを解明するために、その無数の強みと、蛍光を使用するようになりましたが可能である。
Palmは実装するのは簡単ではなく、成功した戦略は、多くの場合、研究対象のシステムのタイプに合わせて調整する必要があります。ここでは、小胞構造の掌の研究を実装する方法を説明し、私たちは海馬ニューロンにおけるDCVS例のための我々のアプローチの有効性を示す。特に、我々は、海馬ニューロンにおけるシナプスへのDCVSの人身売買は、DCVクラスタ5-8によって媒介されるという仮説に対応するために手のひらを使用しています。
Nの開発にシナプス小胞へのクラスタ媒介人身売買euronsそれは急速なシナプスの安定化およびアセンブリ9,10を容易にすることができるので、魅力的な可能性である。 DCVSのクラスタ化された人身売買の支持者は、クラスタリング6を支持する証拠として、外因性のDCV貨物を保有シナプス外蛍光涙の大見かけの大きさを挙げている。しかしながら、これらの斑点は、クラスタリングから生じるものからの回折に起因する特徴的なサイズ効果に適していない回折限界の蛍光顕微鏡技術を用いて生成された画像に現れる。
この問題を解決するために、我々は、従来の広視野蛍光とDCVSを対象とキメラを表現する海馬ニューロンの手のひらの画像を収集した。これらの画像の解析は、従来の画像中の推定シナプス外のDCVクラスターの> 92パーセントが80 nmのPALM画像内の（個々のDCVサイズ）11涙点として解決されることを明らかにした。 hippoca開発にDCVSに適用されるしたがって、これらのデータは、大部分のクラスタリング仮説を無効MPALニューロン。
Protocol
Representative Results
Discussion
PALMおよび関連する超解像蛍光顕微鏡技術は、最近、光学顕微鏡および電子顕微鏡（EM）22-24の良好に確立された形態に貴重な補体として浮上している。手のひらの正の属性は、比較的単純なサンプル調製と最小限のサンプル摂動が含まれています。原理的には、PALMはまた、生きた細胞を研究するために使用することができる。おそらく、PALMの主負属性が有意に生細胞におけるより高…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、とP30（博士ゲイリーオレゴン健康科学大学/ OHSUのバンカーに）国立衛生研究所（NIH）2 R15 GM061539-02（BASへ）を付与し、2 R15 NS40425-03（JEL）は、MH 66179によってサポートされていましたNS061800（OHSUの博士スーアイヒャーまで）。私たちは、海馬ニューロンの文化との広範なサポートのためにバーバラSmoodyに感謝し、博士。この原稿の重要な読書のためのブライアン·ロングとジェームズアブニー。
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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