Super-oppløsning Imaging nevrale Dense-core Blemmer
Summary
Vi beskriver hvordan implementere photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)-baserte studier av vesikler i anleggs, dyrkede nerveceller. Viktige deler av vår protokoll inkluderer merking vesikler med photoconvertible chimeras, samle spredte innsamlede råbilder med en super-oppløsning mikros system, og behandlingen de rå bildene for å produsere en super-oppløsning.
Abstract
Påvisning av fluorescens gir grunnlag for mange allment utnyttet og raskt fremme mikroskopi teknikker ansatt i moderne biologisk og medisinsk bruk. Sterke av fluorescens inkludere sin sensitivitet, spesifisitet, og kompatibilitet med levende avbildning. Dessverre, konvensjonelle former for fluorescens mikros lider av en stor svakhet, diffraksjon begrenset oppløsning i bildeplanet, noe som vanskeliggjør studier av strukturer med dimensjoner mindre enn ~ 250 nm. Nylig har denne begrensningen blitt overvunnet med innføringen av super-oppløsning fluorescens mikroskopi teknikker, for eksempel photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). I motsetning til sine konvensjonelle kolleger, kan PALM produsere bilder med en lateral oppløsning på titalls nanometer. Det er således nå mulig å bruke fluorescens, med sine utallige styrke, for å belyse et spektrum av tidligere utilgjengelige attributter av cellulær struktur og organisering.
_content "> Dessverre er PALM ikke trivielt å implementere, og vellykkede strategier ofte må tilpasses den type system som studeres. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan implementere ensfargede PALM studier av vesikulær strukturer i faste, dyrkede nerveceller. PALM er ideell til studiet av blemmer, som har dimensjoner som vanligvis spenner fra ~ 50-250 nm. Viktige skritt i vår tilnærming inkluderer merking nevroner med photoconvertible (grønn til rød) chimeras av vesikkel last, samle spredte innsamlede rå bilder med en super-oppløsning mikros system, og behandling av RAW-bilder for å produsere en høy oppløsning PALM image. Vi har også demonstrere effekten av vår tilnærming ved å presentere eksepsjonelt godt oppløste bilder av tett-core vesikler (DCVs) i dyrkede hippocampus nevroner, noe som gjendrive hypotesen om at extrasynaptic smugling av DCVs medieres hovedsakelig av DCV klynger.Introduction
En rekke cellulære prosesser avhenger av nøyaktig og effektiv vesikkel-mediert smugling av biomolekyler til bestemte subcellulære destinasjonene. En fremtredende eksempel er synaptic forsamlingen, som innledes med lang rekkevidde, vesikkel-mediert levering av synaptiske bestanddeler fra områder av biogenesis i nevronale soma til potensielt distal pre-og postsynaptiske områder en.
Fluorescens mikroskopi er en kraftfull og populær metode for å studere vesikkel menneskehandel. Sterke av teknikken inkludere sin sensitivitet, spesifisitet, og kompatibilitet med levende avbildning to. Dessverre, inntil ganske nylig, har teknikken lidd av en vesentlig svakhet, diffraksjon-begrenset oppløsning 2, som vanskeliggjør undersøkelser av strukturer med dimensjoner som er mindre enn ~ 250 nm. Nylig, lateral oppløsning i fluorescens mikrosgått diffraksjon barriere med innføringen av super-oppløsning fluorescens microscopy teknikker, for eksempel PALM tre. Den lateral oppløsning på PALM, titalls nanometer, er ideell til studiet av blemmer, som har dimensjoner som vanligvis spenner fra ~ 50-250 nm fire. Det er derfor nå mulig å bruke fluorescens, med sine utallige styrker, for å belyse et spekter av tidligere utilgjengelige attributter av vesikler, inkludert noen aspekter av deres menneskehandel til bestemte subcellulære nettsteder.
PALM er ikke trivielt å implementere, og vellykkede strategier ofte må tilpasses den type system som studeres. Her beskriver vi hvordan du implementerer PALM studier av vesikulær strukturer, og vi demonstrere effekten av vår tilnærming for tilfelle av DCVs i hippocampus nevroner. Spesielt bruker vi PALM å ta hypotesen om at smugling av DCVs til synapser i hippocampus nevroner er mediert av DCV klynger 5-8.
Cluster-mediert smugling av vesikler til synapser i utviklings neurons er en spennende mulighet, fordi det kan bidra til raske synaptiske stabilisering og montering 9,10. Tilhengere av klynget smugling av DCVs sitere den tilsynelatende store størrelsen på extrasynaptic fluorescerende puncta husing eksogene DCV last som bevis som støtter clustering seks. Men disse puncta vises i bilder generert ved hjelp av diffraksjon begrenset fluorescens mikroskopi teknikker, som ikke er egnet til å skille størrelseseffekter som følge av diffraksjon fra dem som skyldes clustering.
For å løse dette problemet, vi samlet konvensjonell widefield fluorescens og PALM bilder av hippocampus nevroner uttrykker chimeras målrettet mot DCVs. Analyse av disse bildene viste at> 92% av antatte extrasynaptic DCV klynger i konvensjonelle bildene er løst som 80 nm (individuell DCV-sized) 11 puncta i PALM bilder. Dermed disse dataene i stor grad oppheve clustering hypotese som gjaldt DCVs i å utvikle hippocampal nevroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM og relaterte super-oppløsning fluorescens mikroskopi teknikker har nylig dukket opp som et verdifullt supplement til bedre etablerte former for optisk mikroskopi og elektronmikroskopi (EM) 22-24. Positive attributter for PALM inkluderer relativt enkel prøveopparbeidelse og minimal prøve forstyrrelse. I prinsippet PALM også kan brukes til å studere levende celler. Sannsynligvis den viktigste negative egenskap av PALM er tidkrevende datainnsamling, som i betydelig grad vanskeliggjør studier av rasker…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir to R15 GM061539-02 (til BAS), 2 R15 NS40425-03 (til JEL), MH 66179 (til Dr. Gary Banker of Oregon Health & Science University / OHSU), og P30 NS061800 (til Dr. Sue Aicher av OHSU). Vi takker Barbara Smoody for omfattende støtte med kulturen i hippocampus nevroner, og legene. Brian Long and James Abney for en kritisk lesning av dette manuskriptet.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
