सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

Summary

यहाँ, हम लगातार परिणाम और बढ़ाया दक्षता को दर्शाता है जो सेंडाइ वायरस, साथ transgene मुक्त मानव iPSCs में मानव दैहिक कोशिकाओं reprogram हमारे स्थापित विधि प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

कुछ साल पहले, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) की स्थापना biomedicine में एक नए युग की शुरुआत की. मानव iPSCs की क्षमता का उपयोग करता मानव आनुवंशिक रोगों की मॉडलिंग रोगजनन, जीन सुधार के बाद ऑटोलॉगस सेल थेरेपी, और रोगी विशेष और लक्षण प्रासंगिक कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करके व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग में शामिल हैं. हालांकि, इस तरह के मानव iPSCs उत्पादन के बाद शेष reprogramming कारक transgene अभिव्यक्ति को नष्ट करने के रूप में कई बाधाओं को पार कर रहे हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, undifferentiated मानव iPSCs में अवशिष्ट transgene अभिव्यक्ति उचित differentiations में बाधा और रोग प्रासंगिक विट्रो phenotypes में की व्याख्या गुमराह कर सकता है. इस कारण के साथ एकीकरण से मुक्त और / या transgene मुक्त मानव iPSCs ऐसे adenovirus, piggyBac प्रणाली, minicircle वेक्टर, episomal वैक्टर, प्रत्यक्ष प्रोटीन वितरण के रूप में कई तरीकों का उपयोग कर विकसित और mRNA संश्लेषित किया गया है. हालांकि, reprogra की दक्षताएकीकरण से मुक्त तरीकों का उपयोग कर mming ज्यादातर मामलों में काफी कम है.

यहाँ, हम सेंडाइ वायरस (आरएनए वायरस) आधारित reprogramming प्रणाली का उपयोग करके मानव iPSCs अलग करने के लिए एक तरीका मौजूद है. इस reprogramming विधि अनुरूप परिणाम और लागत प्रभावी ढंग से उच्च दक्षता को दर्शाता है.

Introduction

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) दवा स्क्रीनिंग के लिए, रोग मॉडलिंग के लिए संभावित रूप से उपयोगी हो सकता है, और रोग और ऊतकों को चोट के इलाज के लिए सेल आधारित चिकित्सा के विकास के लिए जो स्वयं को नवीनीकृत विट्रो में और है pluripotency करने की क्षमता है. हालांकि, hESCs क्योंकि, प्रतिरक्षा आंकलोजिकल और नैतिक बाधाओं के सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए एक सीमा है, और रोग से संबंधित जीन का अध्ययन करने के लिए, रोग विशेष hESCs पूर्व आरोपण आनुवंशिक निदान (PGD) दृष्टिकोण के माध्यम से अलग किया जा सकता है, लेकिन यह अभी भी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और भ्रूण दान बहुत दुर्लभ हैं. इन मुद्दों को प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है, जो स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में प्रगति से संबंधित हैं.

मानव iPSCs आनुवंशिक रूप से मानव वयस्क दैहिक कोशिकाओं से reprogrammed और उन्हें इस तरह के विकास के रूप में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक उपयोगी स्रोत बनाता है जो hESCs के लिए इसी तरह pluripotent स्टेम सेल की तरह सुविधाओं, बंदरगाह रहे हैंगलीचा खोज, रोग मॉडलिंग और रोगी विशेष ढंग ^1,2 में सेल थेरेपी.

अब तक, वायरस की मध्यस्थता (रेट्रोवायरस और adenovirus) सहित मानव iPSCs उत्पन्न करने के लिए कई तरीकों, ^3, गैर वायरस की मध्यस्थता (बीएसी प्रणाली और वैक्टर अभिकर्मक) ⁴ जीन transductions, और प्रोटीन वितरण प्रणाली ^5-7 कर रहे हैं.

वायरस की मध्यस्थता जीन की एक वितरण क्षमता का एक निश्चित स्तर को सुनिश्चित कर सकते हैं कि वे एक अनियंत्रित ढंग से reprogramming जीन व्यक्त करने के लिए मेजबान गुणसूत्रों में एकीकृत क्योंकि, वायरल वैक्टर, आनुवंशिक पदचिह्न छोड़ सकता है. प्रतिलेखन कारक के वायरल एकीकरण को सक्रिय या मेजबान जीन ⁸ निष्क्रिय हो सकता है, तब भी जब यह एक अप्रत्याशित आनुवंशिक विपथन और tumorigenesis ^5,9 का खतरा पैदा कर सकता है. दूसरी ओर, दैहिक कोशिकाओं में प्रोटीन या शाही सेना का प्रत्यक्ष परिचय सूचना दी, लेकिन इस तरह के श्रम प्रधान, दोहराया transf के रूप में कुछ नुकसान गयाection, और ^7,10 reprogramming के निम्न स्तर. यहां तक कि episomal और गैर समेकित करने adenovirus, एडिनो से जुड़े वायरस, और प्लाज्मिड वैक्टर अभी भी ¹¹ अपेक्षाकृत कम कुशल हैं. इन कारणों के लिए, यह iPSC पीढ़ी के उच्च क्षमता और कम आनुवंशिक असामान्यताएं के साथ गैर एकीकरण reprogramming तरीकों चुनने के लिए प्रशंसनीय है. इस अध्ययन में, हम एक सेंडाइ वायरस आधारित reprogramming का उपयोग करें. इस विधि मेजबान जीनोम में गैर एकीकृत और लगातार transgene एकीकरण के बिना मानव iPSCs का उत्पादन हो जाता है.

Protocol

1. सेल की तैयारी और मीडिया (दिवस 1) संस्कृति और DMEM मीडिया 10% FBS युक्त के साथ मानव fibroblast विस्तार. प्लेट मानव fibroblasts पारगमन पहले दिन पर अच्छी तरह से प्रति उचित घनत्व में 24 अच्छी तरह से थाली पर (चित्रा 1). <br…

Representative Results

आमतौर पर संक्रमित fibroblasts सेंडाइ वायरस पारगमन के बाद कई दिनों में किसी भी morphological परिवर्तन नहीं दिखा है, लेकिन पांच दिन बाद वे अलग अलग आकार (चित्रा 1) के लिए शुरू करते हैं. संख्या 1 के एक सही पैनल में …

Discussion

HiPSCs के लिए मानव दैहिक कोशिकाओं reprogramming बुनियादी जीव विज्ञान, निजी चिकित्सा, और प्रत्यारोपण के ¹² में अभूतपूर्व वादों रखती है. इससे पहले, मानव iPSC पीढ़ियों ऐसी दवा के विकास और प्रत्यारोपण चिकित्सा के रूप म…

Materials

CytoTune-iPS Reprogramming Kit	invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X	invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 uM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)	invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid	GIBCO	21985023	1/1000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	cell signaling	4745S	1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody	Santa Cruz	SC-5279	1/1000
Nanog	R&D	AF1997	1/1000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse	invitrogen	948492	1/2000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium	cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745