Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Summary

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Abstract

Há alguns anos, a criação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) marcou o início de uma nova era na área da biomedicina. Os usos potenciais de iPSCs humanos incluem modelagem patogênese de doenças genéticas humanas, a terapia celular autóloga após a correção do gene, e triagem de drogas personalizado, fornecendo uma fonte de células relevantes e sintomas específicos para cada paciente. No entanto, existem vários obstáculos a ultrapassar, tais como a eliminação da expressão do transgene factor de reprogramação remanescente após a produção iPSCs humanos. Mais importante ainda, a expressão do transgene residual em iPSCs humanos indiferenciadas poderia dificultar diferenciações adequadas e desencaminhar a interpretação em fenótipos vitro relevante doença. Com isso, iPSCs humanos sem transgene livre de integração e / ou que tenham sido desenvolvidos usando vários métodos, tais como adenovírus, o sistema piggyBac, minicírculo vetor, vetores epissomais, entrega direta e proteína sintetizada mRNA. No entanto, a eficiência de reprogramming usando métodos livre de integração é bastante baixo na maioria dos casos.

Aqui, apresentamos um método para isolar iPSCs humanos usando Sendai-vírus (vírus RNA) sistema de reprogramação base. Este método de reprogramação mostra resultados consistentes e de alta eficiência em termos de rentabilidade.

Introduction

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm a capacidade de se auto-renovar pluripotência in vitro e têm, o que poderia ser potencialmente útil para a modelagem de doenças, para a triagem de drogas e para desenvolver terapias baseadas em células para tratar lesões e doenças do tecido. No entanto, hESCs tem uma limitação para a terapia de reposição celular por causa de barreiras imunológicas, oncológicas e éticos, e estudar genes de doenças relacionadas, hESCs específicos da doença poderia ser isolado por meio de diagnóstico genético pré-implantação (PGD) se aproxima, mas ainda é tecnicamente desafiador e as doações de embriões são muito raros. Estes problemas estão relacionados com o progresso na biologia das células estaminais, o que levou ao desenvolvimento de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs).

IPSCs humanos são geneticamente reprogramadas a partir de células somáticas adultas humanas e abrigam células-tronco pluripotentes como características semelhantes a hESCs, o que os torna uma fonte útil para a medicina regenerativa, como ddescoberta tapete, modelagem de doença e terapia celular em pacientes específicos ^1,2 maneira.

Até agora, existem vários métodos para gerar iPSCs humanos, incluindo mediada por vírus (retrovírus e adenovírus) ^3, non-vírus mediada (sistema BAC e vetores de transfecção) ⁴ transduções genes e proteínas do sistema de entrega ^5-7.

Embora a entrega de genes mediada por vírus pode garantir um certo nível de eficiência, vectores virais pode deixar pegada genética, porque eles se integram nos cromossomas do hospedeiro para expressar genes de reprogramação de uma maneira descontrolada. Mesmo quando a integração viral de fatores de transcrição podem ativar ou desativar genes do hospedeiro ^8, ele pode causar uma aberração genética inesperado eo risco de desenvolvimento de neoplasias ^5,9. Por outro lado, a introdução directa de proteínas ou RNA em células somáticas foram relatados, mas tem algumas desvantagens, tais como, transf repetido trabalho intensivoexão e baixo nível de reprogramação ^7,10. Mesmo epissómico e não integrante de adenovírus, de vírus adeno-associados, vectores de plasmídeo e ainda são relativamente menos eficiente ^11. Por estas razões, é plausível para escolher métodos de reprogramação não-integração com alta eficácia de geração iPSC e menos anormalidades genéticas. Neste estudo, utilizamos uma reprogramação baseado Sendai-vírus. Este método é conhecido como sendo não integrado no genoma do hospedeiro e produz consistentemente iPSCs humanos sem integração do transgene.

Protocol

1. Preparação de celular e Mídia (Dia 1) Cultura e expandir de fibroblastos humanos com meio DMEM contendo 10% de FBS. Placa de fibroblastos humanos (Figura 1) para uma placa de 24 poços a uma densidade apropriada por poço no dia antes da transdução. NOTA: As seguintes diluições em série são recomendados (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K) porque diferentes tipos de células têm diferentes capacidade de fixação. Incubar as células d…

Representative Results

Normalmente fibroblastos infectados não apresentam quaisquer alterações morfológicas nos vários dias após a transdução de vírus Sendai, mas cinco dias depois, eles começam a ter formas diferentes (Figura 1). Conforme descrito em um painel direito da Figura 1, as células não têm morfologia de fibroblastos típico mais. Eles têm uma forma redonda e núcleo maior do que o citoplasma. Mesmo quando a transdução é realizada em 80% de confluência celular, parece que eles são…

Discussion

Reprogramação de células somáticas humanas para hiPSCs detém promessas sem precedentes na biologia básica, medicina pessoal, e transplante ^12. Anteriormente, as gerações iPSC humanos necessários vírus de DNA que tem risco de integração no genoma do hospedeiro, que pode criar mutações genéticas indesejáveis ​​que limitam outras aplicações clínicas, tais como desenvolvimento de medicamentos e terapias de transplante ^13. Com esta razão, muitos estudos foram relatados para gerar…

Materials

CytoTune-iPS Reprogramming Kit	invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X	invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 uM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)	invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid	GIBCO	21985023	1/1000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	cell signaling	4745S	1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody	Santa Cruz	SC-5279	1/1000
Nanog	R&D	AF1997	1/1000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse	invitrogen	948492	1/2000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium	cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745