센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포
Summary
여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.
Abstract
몇 년 전, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)의 설립은 생물 의학의 새로운 시대를 열었다. 인간 유도 만능의 잠재적 인 사용은 인간의 유전 질환의 모델링 발병 유전자 보정 후자가 세포 치료, 환자 별 증상과 관련된 세포의 소스를 제공함으로써 맞춤 약물 검사를 포함한다. 그러나, 이러한 인간 유도 만능 생산 후 남은 프로그래밍 인자 유전자의 발현을 제거하는 등의 극복하는 여러 장애물이있다. 더 중요한 것은, 미분화 된 인간 유도 만능 잔류 유전자 발현 적절한 분화를 방해하고 질병 관련 체외 표현형에서의 해석을 잘못지도 할 수 있습니다. 이러한 이유와 함께, 통합 – 무료 및 / 또는 유전자가없는 인간 유도 만능는 아데노 바이러스, 피기 백 (PiggyBac) 시스템, minicircle 벡터, 에피 솜 벡터, 직접 단백질 전달과 같은 몇 가지 방법을 사용하여 개발 및 mRNA의 합성되었다. 그러나 reprogra의 효율성통합없는 방법을 사용하여 mming하는 것은 대부분의 경우 매우 낮습니다.
여기서, 우리는 센다이 바이러스 (RNA 바이러스) 기반 프로그래밍 시스템을 사용하여 인간 유도 만능을 분리하는 방법을 제시한다. 이 프로그래밍 방법은 일관된 결과 및 비용 효율적인 방식으로 고성능을 나타낸다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 약물 검사에 대한 질병 모델링을위한 잠재적으로 유용 할 수 있고, 질병 및 조직 손상을 치료하는 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 자기 갱신 시험 관내 및가 능성에 대한 능력을 보유하고 있습니다. 그러나 인간 배아 줄기 세포 때문에, 면역 학적 종양학과 윤리적 장벽의 세포 대체 요법에 대한 제한이 있고, 질병 관련 유전자를 연구, 질병 특정 인간 배아 줄기 세포는 착상 전 유전자 진단 (PGD) 방식을 통해 분리 할 수 있지만, 여전히 기술적으로 도전 및 배아 기증은 매우 드물다. 이러한 문제는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 개발을 주도하고있다 줄기 세포 생물학의 진행과 관련이 있습니다.
인간 유도 만능은 유 전적으로 인간의 성인 체세포에서 프로그램이 다시 그들에게 예 : D 재생 의학을위한 유용한 소스를 만드는 인간 배아 줄기 세포와 유사한 만능 줄기 세포와 같은 기능을 품고있다양탄자 발견, 질병 모델링 및 환자 특정 방식으로 1,2의 세포 치료.
지금까지 바이러스 매개 (레트로 바이러스 및 아데노 바이러스)를 포함하여 인간 유도 만능를 생성하는 여러 가지 방법, 3, 비 바이러스 매개 (BAC 시스템과 벡터의 형질) 4 유전자 transductions 및 단백질 전달 시스템 5-7이 있습니다.
바이러스 매개 유전자 전달 효율의 특정 수준을 보장 할 수 있지만 그들이 통제 할 수없는 방식으로 프로그램을 다시 만들 유전자를 표현하는 호스트의 염색체에 통합하기 때문에, 바이러스 성 벡터는 유전자 발자국을 떠날 수 있습니다. 전사 인자의 바이러스 통합을 활성화하거나 호스트 8 유전자를 불 활성화 할 수 있더라도, 이는 예기치 유전 수차 및 종양의 5,9의 위험을 일으킬 수있다. 한편, 체성 세포로 단백질 또는 RNA의 직접적인 도입은보고 있지만, 이러한 노동 집약적 반복 TRANSF 등의 몇 가지 단점을 가지고 있었다ection 및 7,10 재 프로그램의 낮은 수준입니다. 심지어 에피 솜 및 비 통합 아데노 바이러스, 아데노 – 관련 바이러스, 플라스미드 벡터는 여전히 11 비교적 덜 효율적이다. 이러한 이유로, 그것은 IPSC 세대의 높은 효능과 적은 유전자 이상과 비 통합 프로그램을 다시 만들 방법을 선택하는 그럴듯. 이 연구에서, 우리는 센다이 바이러스 기반 프로그래밍을 사용합니다. 이 방법은 호스트 게놈에 비 통합과 지속적으로 유전자 통합하지 않고 인간 유도 만능를 생산하는 것으로 알려져있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSCs에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 것은 기본 생물학, 개인 의학 및 이식 12 전례없는 약속을 보유하고 있습니다. 이전에, 인간의 IPSC 세대는 의약품 개발과 이식 치료 13으로 추가 임상 응용 프로그램을 제한하는 바람직하지 않은 유전자 변이를 만들 수 있습니다 호스트 게놈으로 통합 위험이 DNA 바이러스를 요구했다. 이러한 이유로, 많은 연구는 여러 다른 방법으로 벡터 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
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