仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞
Summary
ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。
Abstract
数年前、人間の人工多能性幹細胞（iPS細胞）の設立は、生物医学の新時代が幕を開けた。ヒトiPS細胞の潜在的な使用は、ヒト遺伝性疾患の病因モデリング、遺伝子修正後の自己細胞療法、および患者特有の症状と関連する細胞の供給源を提供することによってパーソナライズされた薬剤スクリーニングが挙げられる。しかしながら、このようなヒトiPS細胞の製造後に残留する初期化因子の導入遺伝子発現を排除するような克服するため、いくつかのハードルが存在する。さらに重要なことは、未分化ヒトiPS細胞の残留導入遺伝子の発現は、適切な分化を阻害し、in vitroの表現型における疾患関連の解釈を誤った方向へ導くことができます。このような理由で、統合のない、および/または導入遺伝子のない人間性IPSCは、アデノウイルスは、piggyBacシステム、ミニサークルベクター、エピソームベクター、直接のタンパク質送達と合成されたmRNAのようないくつかの方法を使用して開発されている。しかし、reprograの効率統合のない方法を用いてmmingは、ほとんどの場合、非常に低い。
ここでは、センダイウイルス（RNAウイルス）ベースの再プログラミングシステムを用いてヒトiPS細胞を単離するための方法を提示する。この初期化方法は、費用対効果の高い方法で一貫した結果、高効率を示している。
Introduction
ヒト胚性幹細胞（hESC）は、自己再生をインビトロで多能性を有し、薬物スクリーニング、疾患のモデリングのための潜在的に有用である可能性があり、疾患および組織傷害を治療するための細胞ベースの治療法を開発するための能力を有する。しかし、ヒトES細胞が原因、免疫学、腫瘍学、倫理的な障壁の細胞置換療法には限界があり、病気に関連する遺伝子を研究するために、疾患特異的ヒトES細胞は、着床前遺伝子診断（PGD）アプローチによって単離することができたが、それはまだ技術的に困難であるおよび胚の寄付はかなり稀である。これらの問題は、誘導多能性幹細胞（hiPSCs）の開発につながっている幹細胞生物学の進歩に関連している。
人間性IPSCは、遺伝的にヒト成人の体細胞から再プログラムし、それらには、Dなどの再生医療のための有用な供給源となるヒトES細胞に類似した多能性幹細胞のような特性を抱いている患者固有の方法1,2での敷物の発見、病気のモデリングと細胞療法。
今まで、ウイルス媒介（レトロウイルスおよびアデノウイルス）を含むヒトiPS細胞を生成するためのいくつかの方法、3、非ウイルス媒介（BAC系およびベクターのトランスフェクション）4遺伝子形質導入、およびタンパク質送達システム5-7が存在する。
ウイルス媒介性遺伝子の送達効率をある程度確保することができるが、それらは制御されない様式で初期化遺伝子を発現するために宿主染色体に統合するので、ウイルスベクターは、遺伝的フットプリントを残すことができる。転写因子のウイルス組込みは、宿主遺伝子を活性化する8又は不活性化することができる場合であっても、予想外の遺伝子異常5,9および腫瘍形成のリスクを引き起こす可能性がある。一方、体細胞へのタンパク質又はRNAの直接的な導入が報告されているが、このような労働集約的な繰り返し変圧などのいくつかの欠点を有したECTION、および7,10の再プログラミングの低レベル。偶数エピソームおよび非組み込み型アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびプラスミドベクターは、依然として比較的効率的である11。これらの理由から、IPSCの発生の高い有効性と少ない遺伝子異常を持つ非統合書き換え方法を選択することが妥当である。本研究では、仙台ウイルスベースのプログラミングを使用しています。この方法は、宿主ゲノムに統合されていないと一貫して導入遺伝子の統合なしにヒトiPS細胞を産生することが知られている。
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSCsにヒト体細胞を再プログラミングすることは、基本的な生物学、個人的な医学、移植12で前例のない約束を保持している。このような薬剤の開発および移植治療13などのさらなる臨床応用を制限する望ましくない遺伝子変異を作成することができ、宿主ゲノムへと統合リスクが以前に、人間のIPSC世代に必要なDNAウイルス。このような理由で、多くの研究は、いくつかの代…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿上で貴重な議論のためにイ·ラボのメンバーに感謝したいと思います。李研究室での作業は、細胞研究基金（TEDCO）を幹ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン研究者賞からメリーランド州からの補助金によって支えられている。
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
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