स्थिर आइसोटोप लेबल के लिए reductive Dimethylation का प्रयोग मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स
Summary
Reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) द्वारा पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए एक तेजी से, सस्ती रणनीति है. यहाँ हम लगभग किसी भी नमूना प्रकार से लागू किया जा सकता है कि Redi दृष्टिकोण का उपयोग प्रोटीन मिश्रण से तैयार करने और विश्लेषण के लिए एक मजबूत विधि प्रदर्शित करता है.
Abstract
Reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) द्वारा पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग सही मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग नमूनों के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति मतभेद यों की एक विधि है. Redi लेबलिंग प्रत्येक मुक्त amine को दो मिथाइल समूह जोड़ने के लिए नियमित रूप से (प्रकाश) या formaldehyde और सोडियम cyanoborohydride के deuterated (भारी) रूपों का उपयोग किया जाता है. यहाँ हम Redi लेबलिंग और जटिल प्रोटीन मिश्रण की मात्रात्मक तुलना के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. तुलना के लिए प्रोटीन के नमूने प्रकाश या भारी मिथाइल टैग, मिश्रित, और LC-MS/MS द्वारा सह विश्लेषण किया या तो ले जाने के लिए लेबल पेप्टाइड्स, में से पच जाता है. सापेक्ष प्रोटीन abundances पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा से निकाले घटक पेप्टाइड भारी और प्रकाश लेबल संस्करणों की आयन वर्णलेख शिखर क्षेत्रों की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. यहाँ वर्णित विधि नमूना उलट चरण ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा तैयारी, पेप्टाइड्स पर स्तंभ Redi लेबलिंग, बुनियादी पीएच राजस्व द्वारा पेप्टाइड fractionation शामिलersed चरण (BPRP) क्रोमैटोग्राफी, और StageTip पेप्टाइड शुद्धि. हम स्थिर आइसोटोप शामिल करने के लिए अन्य तरीकों के संबंध में Redi लेबलिंग के फायदे और सीमाओं पर चर्चा की. हम नमूने के लगभग किसी भी प्रकार में प्रोटीन abundances तुलना करने के लिए एक तेज, सस्ता, और सही तरीके के रूप में Redi लेबलिंग का उपयोग उपन्यास अनुप्रयोगों पर प्रकाश डाला.
Introduction
जटिल नमूने के बीच कई प्रोटीन की एकाग्रता अंतर को मापने प्रोटिओमिक्स में एक केंद्रीय चुनौती है. तेजी से, यह अलग समस्थानिक टैग के साथ प्रत्येक नमूने में प्रोटीन लेबलिंग नमूने के संयोजन, और एकाग्रता मतभेद यों मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके किया जा रहा है. कई तरीकों प्रोटीन और पेप्टाइड्स के स्थिर समस्थानिक लेबलिंग के लिए मौजूद हैं. ICAT 3, iTRAQ 4, और कमी dimethylation 5 प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन के बाद स्थिर आइसोटोप टैग जोड़ने जबकि 15 एन लेबलिंग 1 और SILAC 2, विवो में पाचन समस्थानिक लेबल परिचय. इन तरीकों के अलावा, reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) नमूने के लगभग किसी भी प्रकार में प्रोटीन एकाग्रता मतभेद यों के लिए एक सस्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति के रूप में लोकप्रिय हो रहा है.
Redi लेबलिंग तो कम हो जाता है, जो एक Schiff आधार, के लिए फार्म formaldehyde के साथ प्रतिक्रिया पेप्टाइड्स शामिलcyanoborohydride द्वारा. यह प्रतिक्रिया एन टर्मिनी और लाइसिन पक्ष श्रृंखला और monomethylates एन टर्मिनल prolines पर मुक्त एमिनो समूहों dimethylates. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल deuterated formaldehyde और cyanoborohydride (चित्रा 1) का उपयोग कर एक "भारी" लेबल के साथ अपने प्राकृतिक समस्थानिक वितरण और नमूना 2 में हाइड्रोजन परमाणुओं के साथ अभिकर्मकों का उपयोग कर एक "प्रकाश" लेबल के साथ नमूना 1 में पेप्टाइड्स methylates. प्रकाश और एक मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग दो रूपों के बीच भेद करने के लिए कार्यरत है जो भारी रूपों में 6.0377 दा के एक बड़े पैमाने पर अंतर में एक पेप्टाइड परिणामों पर प्रत्येक dimethylated एमिनो समूह. विशेष रूप से, रिश्तेदार पेप्टाइड abundances प्रकाश की MS1 निकाले आयन वर्णलेख क्षेत्रों का अनुपात (MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात) और प्रत्येक पेप्टाइड आयन जोड़ी के लिए भारी संस्करण के रूप में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. एक प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत प्रोटीन में सभी पेप्टाइड्स के बीच मंझला MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात के रूप में गणना की है. इस रिपोर्ट में, हम आचरण के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णनउलट चरण पेप्टाइड ठोस चरण निष्कर्षण, पर स्तंभ Redi लेबलिंग, पेप्टाइड fractionation बुनियादी पीएच द्वारा चरण (BPRP) क्रोमैटोग्राफी उलट, और StageTips का उपयोग पेप्टाइड मिश्रण की शुद्धि (चित्रा 2) भी शामिल है कि LC-MS/MS द्वारा Redi लेबलिंग प्रयोगों आईएनजी . हम मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए Redi लेबलिंग का उपयोग करने के फायदे और सीमाओं पर चर्चा की.
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च सस्ती लेबलिंग अभिकर्मकों (अभिकर्मकों नमूना प्रति कम से कम $ 1 लागत), तेजी से प्रतिक्रिया की दर (~ 10 मिनट), पक्ष उत्पादों का अभाव,: कई जगहों मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए एक आकर्षक विधि reductive dimethylation (Redi ले?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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