Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado
Summary
Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.
Abstract
Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es un método para cuantificar con precisión las diferencias de expresión de proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas. Etiquetado REDI se lleva a cabo utilizando formas regulares deuterados (pesados) de formaldehído y cianoborohidruro de sodio (luz) o para agregar dos grupos metilo a cada amina libre. Aquí se demuestra un protocolo robusto para el etiquetado Redi y la comparación cuantitativa de mezclas complejas de proteínas. Proteína muestras para la comparación se digieren en péptidos, etiquetados para llevar la luz o las etiquetas de metilo pesados, mezclados, y co-analizados por LC-MS/MS. Abundancias de proteínas relativas se cuantificaron mediante la comparación de las áreas de los picos del cromatograma de iones de versiones pesadas y ligeras marcados de la péptido constituyente extraído de la plena espectros de MS. El método descrito aquí incluye preparación de la muestra por extracción en fase sólida de fase inversa, etiquetado Redi en columna de péptidos, péptido fraccionamiento por rev de pH básicofase ersed (BPRP) cromatografía y purificación de péptidos StageTip. Se discuten las ventajas y limitaciones de etiquetado Redi con respecto a otros métodos para la incorporación de isótopos estables. Destacamos las nuevas aplicaciones utilizando el etiquetado Redi como un método rápido, económico y preciso para comparar la abundancia de proteínas en casi cualquier tipo de muestra.
Introduction
Medición de diferencias de concentración de muchas proteínas entre muestras complejas es un reto central en la proteómica. Cada vez más, esto se hace mediante el etiquetado de proteínas en cada muestra con diferentes etiquetas isotópicas, la combinación de las muestras, y el uso de la espectrometría de masas para cuantificar las diferencias de concentración. Existen varios métodos para el marcaje isotópico estable de proteínas y péptidos. 15 N etiquetado 1 y 2 SILAC introducen marcadores isotópicos metabólicamente in vivo, mientras que iCAT 3, iTRAQ 4, y la reducción de dimethylation 5 agregan etiquetas de isótopos estables después de la extracción de proteínas y la digestión. Entre estos métodos, dimetilación reductora (etiquetado Redi) está ganando popularidad como un método económico y reproducible para cuantificar las diferencias de concentración de proteína en casi cualquier tipo de muestra.
Etiquetado Redi implica péptidos que reaccionan con el formaldehído para formar una base de Schiff, que se reduce luegode cianoborohidruro. Esta reacción dimethylates grupos amino libres en N-terminales y cadenas laterales de lisina y monomethylates prolinas N-terminales. El protocolo descrito aquí methylates péptidos en la muestra 1 con una etiqueta de "luz" usando reactivos con átomos de hidrógeno en su distribución isotópica natural y la muestra 2 con una etiqueta de "pesado" con formaldehído deuterado y cianoborohidruro (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado en un péptido da como resultado una diferencia de masa de 6,0377 Da entre la luz y las formas pesados, que se emplea para distinguir entre las dos formas utilizando un espectrómetro de masas. Específicamente, las abundancias relativas de péptidos se cuantifican como la relación de áreas cromatograma de iones extraídos MS1 (relación de área de pico MS1) de la luz y la versión pesada para cada par de iones de péptido. La abundancia relativa de una proteína se calcula como la mediana relación de área de pico MS1 entre todos los péptidos en la proteína. En este reporte se describe un protocolo robusto por conductaing experimentos de etiquetado Redi por LC-MS/MS que incluye la extracción de fase inversa de péptidos en fase sólida, etiquetado Redi en columna, fraccionamiento por pH básico péptido en fase inversa (BPRP) cromatografía, y la purificación de mezclas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Se discuten las ventajas y limitaciones del uso de etiquetado Redi para proteómica cuantitativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios puntos hacen que el etiquetado de isótopos estables de péptidos utilizando un método atractivo para proteómica cuantitativa dimethylation reductora (etiquetado REDI): reactivos baratos etiquetado (reactivos cuestan menos de $ 1 por muestra), la velocidad de reacción rápida (~ 10 min), ausencia de productos secundarios, altas reproducibilidad (Figuras 3, 4), productos de reacción estable, capacidad de utilizar cualquier proteasa y de alta eficiencia de ionización de péptidos marcados. Eti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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