La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling
Summary
Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.
Abstract
Etichettatura isotopi stabili di peptidi di dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un metodo per quantificare con precisione le differenze di espressione proteica tra campioni utilizzando la spettrometria di massa. Etichettatura Redi viene eseguita utilizzando sia regolare (luce) o deuterati (pesanti) forme di formaldeide e sodio cianoboroidruro di aggiungere due gruppi metilici ad ogni ammina libera. Qui mostriamo un protocollo robusto per l'etichettatura Redi e comparazione quantitativa di miscele di proteine complesse. Campioni di proteine di confronto vengono digeriti in peptidi, etichettati a portare luce o tag metilici pesanti, mescolato, e co-analizzati mediante LC-MS/MS. Abbondanze relative di proteina sono quantificate confrontando le aree di picco di ioni cromatogramma delle versioni etichettate pesanti e leggeri del peptide costituente estratto dalla piena MS spettri. Il metodo qui descritto comprende la preparazione del campione mediante estrazione in fase solida in fase inversa, etichettatura Redi on-column di peptidi, peptide frazionamento da pH rev basefase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip depurazione peptide. Discutiamo vantaggi ei limiti di etichettatura Redi rispetto ad altri metodi per isotopi stabili incorporazione. Evidenziamo nuove applicazioni utilizzando etichettatura Redi come un metodo rapido, economico e preciso per confrontare le abbondanze di proteine in quasi ogni tipo di campione.
Introduction
Misurare differenze di concentrazione di molte proteine tra i campioni complessi è una sfida centrale in proteomica. Sempre più spesso, questo viene fatto etichettando le proteine in ogni campione con diversi tag isotopiche, mescolando i campioni, e l'utilizzo di spettrometria di massa per quantificare le differenze di concentrazione. Esistono diversi metodi per l'etichettatura isotopica stabile di proteine e peptidi. 15 N etichettatura 1 e 2 SILAC introdurre etichette isotopiche metabolicamente in vivo, che iCAT 3, iTRAQ 4, e la riduzione dimethylation 5 aggiungere tag isotopi stabili dopo l'estrazione delle proteine e la digestione. Tra questi metodi, dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) sta guadagnando popolarità come un poco costoso, metodo riproducibile per quantificare le differenze di concentrazione di proteine in quasi ogni tipo di campione.
Etichettatura REDI comporta peptidi che reagiscono con formaldeide per formare una base di Schiff, che viene poi ridottoda cianoboroidruro. Questa reazione dimethylates gruppi amminici liberi su N-Termini e laterali lisina catene e monomethylates proline N-terminale. Il protocollo qui descritto metila peptidi nel campione 1 con un'etichetta "luce" utilizzando reagenti con atomi di idrogeno nella loro distribuzione isotopica naturale e campione 2 con un'etichetta "pesante" utilizzando formaldeide deuterato e cianoboroidruro (Figura 1). Ogni gruppo amminico dimetilato su un peptide provoca una differenza di massa di 6,0377 Da tra luce e forme pesanti, che viene impiegata per distinguere tra i due moduli utilizzando uno spettrometro di massa. In particolare, abbondanze peptide relativi vengono quantificati come rapporto delle aree cromatogramma ionico MS1 estratti (MS1 rapporto dell'area di picco) di luce e versione pesante per ogni coppia peptide ione. L'abbondanza relativa di una proteina è calcolato come rapporto mediano area del picco MS1 tra tutti i peptidi della proteina. In questo rapporto, descriviamo un protocollo robusto per comportamentozione esperimenti di marcatura Redi da LC-MS/MS che include peptide estrazione a fase inversa in fase solida, etichettatura on-column Redi, peptide frazionamento da pH basico fase (BPRP) cromatografia inversa, e la purificazione di miscele di peptidi utilizzando StageTips (Figura 2) . Discutiamo vantaggi ei limiti di utilizzo etichettatura redi per proteomica quantitativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numerosi punti fanno etichettatura isotopo stabile di peptidi utilizzando un metodo interessante per la proteomica quantitativa dimethylation riduttiva (etichettatura Redi): reagenti poco costosi di etichettatura (reagenti costano meno di $ 1 per esempio), velocità di reazione rapida (~ 10 min), assenza di prodotti collaterali, alte riproducibilità (figure 3, 4), prodotti di reazione stabili, capacità di utilizzare qualsiasi proteasi e ad alta efficienza di ionizzazione dei peptidi marcati. Etichetta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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