환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.
환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확하게 질량 분석기를 사용하여 샘플 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 방법입니다. REDI 라벨은 각각의 유리 아민에 두 개의 메틸 그룹을 추가하기 위해 정기적 (빛) 또는 포름 알데히드와 나트륨 시아 노보로 하이드 라이드의 중수 (무거운) 양식을 사용하여 수행됩니다. 여기에서 우리는 REDI 표시와 복잡한 단백질 혼합물의 정량 비교를위한 강력한 프로토콜을 보여줍니다. 비교를 위해 단백질 시료는 빛 또는 무거운 메틸 태그, 혼합하고, LC-MS/MS 공동 분석 중 하나를 수행하는 레이블 펩타이드로 분해된다. 상대 단백질의 개체수는 전체 MS 스펙트럼에서 추출 된 성분 펩타이드의 무겁고 가벼운 표시된 버전의 이온 크로마토 그램의 피크 면적을 비교하여 정량화. 여기에서 설명하는 방법은 샘플 역상 고상 추출에 의한 제조, 펩타이드에 열 REDI 라벨, 기본 산도 회전에 의해 펩타이드 분획을 포함ersed 상 (BPRP) 크로마토 그래피 StageTip 펩티드 정제. 우리는 안정 동위 원소의 설립을위한 다른 방법에 대한 REDI 라벨의 장점과 한계에 대해 설명합니다. 우리는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질의 개체수를 비교하는 빠르고, 저렴하고 정확한 방법으로 REDI 라벨을 사용하여 새로운 응용 프로그램을 강조 표시합니다.
복잡한 시료 사이에 많은 단백질의 농도 차이를 측정하는 것은 단백질 체학의 중심 과제이다. 점점이 서로 다른 동위 원소의 태그를 각 샘플에서 단백질을 라벨 샘플을 결합하고, 농도의 차이를 정량화하기 위해 질량 분석기를 사용하여 수행되고있다. 몇 가지 방법은 단백질과 펩타이드의 안정 동위 원소 표지 존재한다. ICAT 3, iTRAQ 4, 환원 디메틸 화 5 단백질 추출 및 소화 후 안정 동위 원소의 태그를 추가하는 반면 15 N 표시 1 SILAC 2, 생체 내에서 대사 동위 원소 라벨을 소개합니다. 이러한 방법 중에서, 환원 디메틸 화 (REDI 라벨링)는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질 농도 차이를 정량화 할 수있는 저렴하고 재현성있는 방법으로 인기를 얻고있다.
REDI 라벨은 감소 쉬프 기반을 형성하는 포름 알데히드와 반응 펩티드를 포함노보로 하이드 라이드로. 이 반응은 N-말단 및 리신 측쇄 monomethylates 및 N-말단에 프롤린 자유 아미노기를 dimethylates. 여기에 설명 된 프로토콜은 중수 소화 포름 알데히드와 노보로 하이드 라이드 (그림 1)를 사용하여 "무거운"레이블이 자연 동위 원소 분포와 샘플 2의 수소 원자와 시약을 사용하여 "빛"라벨 샘플 1 펩티드를 methylates. 빛과 질량 분석기를 이용하여 두 형태를 구별하기 위해 사용되는 무거운 형태 사이 6.0377 다의 질량 차이로 펩티드 결과의 각 dimethylated 아미노기. 구체적으로는, 상대 펩티드 존재비는 광의 MS1 추출 이온 크로마토 영역 비율 (MS1 피크 면적비) 및 각 펩티드 이온 쌍 무거운 버전으로 정량화된다. 단백질의 상대적인 풍부함이 단백질에있는 펩티드들 중앙값 MS1 피크 면적의 비율로서 계산된다. 이 보고서에서, 우리는 행위에 대한 강력한 프로토콜을 설명역상 펩타이드 고체상 추출에 열 REDI 라벨링, 펩티드 분획 염기성 pH 기준 위상 (BPRP) 크로마토 그래피를 반전하고 StageTips를 이용 펩타이드 혼합물의 정제 (도 2)를 포함 LC-MS/MS에 의해 REDI 라벨링 실험을 보내고 . 우리는 정량 프로테오믹스에 대한 REDI 라벨 사용의 장점과 한계에 대해 설명합니다.
높은 저렴한 라벨 시약 (시약은 샘플 당 1 달러 미만의 비용), 빠른 반응 속도 (~ 10 분), 부산물의 부재 : 몇 가지 점은 양적 proteomics의 매력적인 방법 환원 디메틸 화 (REDI 라벨)를 사용하여 펩티드의 안정 동위 원소 라벨링을 재현성 (도 3,도 4), 안정적인 반응 생성물, 임의의 단백질 분해 효소를 사용하는 능력 및 표지 된 펩티드의 높은 이온화 효율. 이 합성 중간에 특정 아미노산 auxotrop…
The authors have nothing to disclose.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |