Stabile isotoper merking av peptider ved reduktiv dimethylation (Redi merking) er en rask, billig strategi for nøyaktige massespektrometri-basert kvantitative proteomikk. Her vi viser en robust fremgangsmåte for fremstilling og analyse av proteinblandinger ved hjelp av REDI tilnærming som kan brukes på nesten hvilken som helst prøvetype.
Stabile isotoper merking av peptider ved reduktiv dimethylation (Redi merking) er en metode for å nøyaktig kvantifisere protein expression forskjeller mellom prøver ved hjelp av massespektrometri. Redi merkingen utføres ved hjelp av enten vanlig (lett) eller deuterert (tung) former av formaldehyd og natrium-cyanoborhydrid for å legge til to metylgrupper på hver frie amin. Her viser vi en robust protokoll for Redi merking og kvantitativ sammenligning av komplekse proteinblandinger. Protein prøver for sammenligning er fordøyd i peptider, merket å bære enten lys eller tunge metyl-koder, blandet, og co-analysert ved LC-MS/MS. Relative protein Forekomsten blir kvantifisert ved å sammenligne ion kromatogram topparealene for tunge og lette merkede versjoner av de bærende peptidet ekstrahert fra den fullstendige MS-spektra. Fremgangsmåten beskrevet her omfatter prøvepreparering ved reversfase fastfase-ekstraksjon, på en kolonne REDI merking av peptider, peptid fraksjonering ved basisk pH omdrersed-fase (BPRP) kromatografi og StageTip peptid rensing. Vi diskuterer fordeler og begrensninger av Redi merking med hensyn til andre metoder for stabile isotoper innlemmelse. Vi trekker frem nye applikasjoner ved hjelp av Redi merking som en rask, billig, og nøyaktig metode for å sammenligne protein i hopetall i nesten hvilken som helst type prøve.
Måling konsentrasjonsforskjeller av mange proteiner mellom komplekse prøver er en sentral utfordring i proteomikk. I økende grad dette blir gjort ved merking av proteiner i hver prøve med forskjellige isotoper koder, som kombinerer prøvene, og ved hjelp av massespektrometri til kvantifisere konsentrasjonsforskjeller. Det finnes flere metoder for stabil isotoper merking av proteiner og peptider. 15 N merking ett og SILAC 2 introdusere isotopmarkører metabolsk in vivo, mens ICAT 3, iTRAQ 4, og reduksjon dimethylation fem legge stabile isotopen koder etter protein utvinning og fordøyelse. Blant disse fremgangsmåter, er reduktiv dimethylation (REDI merking) økende popularitet som en billig, reproduserbar metode for å kvantifisere protein konsentrasjonsforskjeller i nesten hvilken som helst type prøve.
Redi merking involverer reagering peptider med formaldehyd for å danne en Schiff-base, som deretter reduseresetter cyanoborhydrid. Denne reaksjonen dimethylates frie amino-grupper på N-termini og lysin sidekjeder og monomethylates N-terminale prolinene. Protokollen er beskrevet her methylates peptider i prøven 1 med en «lett» etiketten med reagenser med hydrogenatomer i deres naturlige isotoper fordeling og prøven 2 med en "tung" label med deuterert formaldehyd og natriumcyanoborhydrid (figur 1). Hver dimethylated aminogruppe på et peptid resulterer i en masseforskjell på 6,0377 Da mellom lette og tunge former, som er anvendt for å skille mellom de to former ved hjelp av et massespektrometer. Nærmere bestemt, er relative peptid Forekomsten kvantifisert som forholdstallet for MS1 ekstrahert ion kromatogram områder (MS1 toppareal-forhold) av lette og tunge versjon for hvert peptid ionepar. Den relative mengde av et protein som er beregnet som median MS1 toppareal-forhold blant alle peptider i proteinet. I denne rapporten beskriver vi en robust protokoll for oppførseling Redi merkingseksperimenter ved LC-MS/MS som omfatter reversert-fase-peptid-faststoff-fase-ekstraksjon, på en kolonne REDI merking, peptid fraksjonering ved basisk pH reversert fase (BPRP) kromatografi og rensing av peptid-blandinger ved hjelp av StageTips (Figur 2) . Vi diskuterer fordeler og begrensninger ved bruk av Redi merking for kvantitative proteomikk.
Flere punkter gjør stabile isotoper merking av peptider ved hjelp av reduktiv dimethylation (Redi merking) en attraktiv metode for kvantitative proteomikk: billig merking reagenser (reagenser koster mindre enn $ 1 per prøve), rask reaksjonshastighet (~ 10 min), fravær av sideprodukter, høye reproduserbarhet (figur 3, 4), stabile reaksjonsprodukter, evne til å bruke noen protease, og høy ionisering effektivitet av merkede peptider. Kjemisk merking av Redi er også fordelaktig i forhold til metabols…
The authors have nothing to disclose.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |