Kvantitativa Proteomics Använda Reduktiv dimetylering för Stable Isotope Labeling
Summary
Stabil isotopmärkning av peptider genom reduktiv dimetylering (redi märkning) är en snabb, billig strategi för noggranna masspektrometri-baserad kvantitativa proteomik. Här visar vi en robust metod för beredning och analys av proteinblandningar med hjälp av redi strategi som kan tillämpas på nästan alla prov typ.
Abstract
Stabil isotopmärkning av peptider genom reduktiv dimetylering (redi märkning) är en metod att exakt kvantifiera proteinuttrycksskillnader mellan prover med masspektrometri. Redi märkning utförs med antingen vanlig (ljus) eller deutererade (tunga) former av formaldehyd och natriumcyanoborhydrid att lägga två metylgrupper till varje fri amin. Här visar vi en robust protokoll för redi märkning och kvantitativ jämförelse av komplexa proteinblandningar. Protein prover för jämförelse smälts in i peptider, märkt att bära antingen lätta eller tunga metyl-taggar, blandade, och co-analyseras av LC-MS/MS. Relativa protein abundances kvantifieras genom att jämföra jonkromatogram toppytorna för tunga och lätta märkta versioner av drifts peptiden extraheras från hela MS-spektra. Metoden som beskrivs här innefattar provberedning genom omvänd fas-fast fas-extraktion, i kolonnen Redi märkning av peptider, peptid fraktionering med basiskt pH reversed-fas (BPRP) kromatografi och StageTip peptidrening. Vi diskuterar fördelar och begränsningar med Redi märkning med avseende på andra metoder för stabila isotopen inkorporering. Vi belyser nya applikationer med hjälp Redi märkning som en snabb, billig och säker metod för att jämföra protein abundances i nästan alla typer av prov.
Introduction
Att mäta koncentrationsskillnader av många proteiner mellan komplexa prover är en central utmaning i proteomik. Alltmer, detta görs genom att märka proteiner i varje prov med olika isotop-taggar, som kombinerar proverna, och med hjälp av masspektrometri för att kvantifiera skillnaderna koncentrations. Det finns flera metoder för stabil isotopisk märkning av proteiner och peptider. 15 N märkning 1 och SILAC 2 införa isotopmarkörer metaboliskt in vivo, medan ICAT 3, iTRAQ 4, och reduktion dimetylering 5 lägga stabila isotoptaggar efter proteinextraktion och matsmältning. Bland dessa metoder är reduktiv dimetylering (redi märkning) ökar i popularitet som en billig och reproducerbar metod för att kvantifiera proteinkoncentrations skillnader i nästan alla typer av prov.
Redi märkning involverar reagerande peptider med formaldehyd för att bilda en Schiffsk bas, som därefter reducerasav cyanoborhydrid. Denna reaktion dimethylates fria aminogrupper på N-terminalen och lysinsidokedjor och monomethylates N-terminal proliner. Protokollet som beskrivs här metylerar peptider i prov 1 med en "lätt" etikett med reagenser med väteatomer i sin naturliga utbredning isotop-och prov 2 med en "tung" etikett med deutererad formaldehyd och cyanborhydrid (figur 1). Varje dimetylerade aminogrupp på en peptid resulterar i en massa skillnad på 6,0377 Da mellan lätta och tunga former, som används för att skilja mellan de två formerna med hjälp av en masspektrometer. Närmare bestämt är de relativa peptid abundances kvantifierats som förhållandet MS1 extraherade jonkromatogram utrymmen (MS1 topparea-förhållande) av lätt och tung version för varje peptid jonpar. Den relativa förekomsten av ett protein beräknas som median MS1 toppareaförhållandet mellan alla peptider i proteinet. I denna rapport beskriver vi ett robust protokoll för uppförandeing Redi märkningsexperiment genom LC-MS/MS som inkluderar omvänd fas peptid fastfasextraktion, on-column Redi märkning, peptid fraktionering med basiskt pH med omvänd fas (BPRP) kromatografi och rening av peptidblandningar med användning StageTips (Figur 2) . Vi diskuterar fördelar och begränsningar med att använda Redi märkning av kvantitativa proteomik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera punkter gör stabila isotopen märkning av peptider med hjälp av reduktiv dimetylering (redi märkning) en attraktiv metod för kvantitativ proteomik: billiga märkningsreagens (reagenser kostar mindre än $ 1 per prov), snabb reaktionshastighet (~ 10 min), frånvaro av sidoprodukter, hög reproducerbara (figurerna 3, 4), stabila reaktionsprodukter, förmåga att använda något proteas, och hög joniseringseffektivitet av märkta peptider. Kemisk märkning av Redi är också fördelaktigt i för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
