השימוש בגז כרומטוגרפיה לנתח הלחנה שינויים של חומצות שומן ברקמות חולדה כבד במהלך הריון
Summary
הריון גורם לשינויים משמעותיים בהרכב חומצות שומן של רקמות אימהיות. ניתן להשיג פרופילי שומנים בדם באמצעות גז כרומטוגרפיה כדי לאפשר זיהוי וכימות של חומצות שומן בכיתות שומנים בודדות בקרב חולדות קבלו תזונה שומן גבוה ונמוך שונות במהלך הריון.
Abstract
גז כרומטוגרפיה (GC) היא שיטה רגישה מאוד המשמשת לזיהוי ולכמת את תכולת חומצות שומן של שומנים ברקמות, תאים ופלזמה / סרום, מניב תוצאות ברמת דיוק גבוהה ושחזור גבוה. במחקרים מטבוליים והתזונה GC מאפשר הערכה של שינויים בריכוז חומצות השומן הבאים התערבויות או במהלך שינויים במצב פיסיולוגי כגון הריון. מיצוי שלב מוצק (SPE) באמצעות aminopropyl מחסניות סיליקה מאפשר הפרדה של מעמדות שומנים בדם הגדולות, כולל triacylglycerols, פוספוליפידים שונים, ואסטרים כולסטריל (CE). GC בשילוב עם SPE שימש כדי לנתח את השינויים בהרכב חומצות שומן של שבריר CE בכבדים של חולדות בתולה והרות שקבלו תזונה שומן גבוהה ונמוכה שונות. ישנן השפעות אינטראקציה דיאטה / הריון משמעותיות על תכולת חומצות אומגה 3 ואומגה 6 וחומצות השומן של CE כבד, מצביעים על כך שנשים בהריון יש תגובה שונה לmanipulat התזונתייון ממה שראה אצל נקבות בתולה.
Introduction
גז כרומטוגרפיה (GC) היא טכניקה מבוססת היטב המשמשת לזיהוי ולכמת את השילוב של חומצות שומן לתוך בריכות שומנים בדם וקרומים תא 1,2 בתנאי תוספים או פיסיולוגיים כמו השמנה (ומחלות הקשורות כגון סוכרת) או הריון – 3 5. זה מתאים גם לניתוח הסוגים והכמויות של שומנים במזון. זה שימושי כאשר אפיון דיאטות ניסיוניות, כמו גם להבטיח כי תעשיית המזון עומדת בתקנות. לדוגמא, GC ניתן להשתמש כדי לאשר את זהותו וכמות של חומצות שומן בתוך מוצר כגון תוסף תזונה כדי להבטיח התיוג שהוא נכון ותקנות הם דבקו 6,7. ניתוח של חומצות שומן יכול לספק תובנות רבות ערך חילוף חומרים של שומנים בבריאות ובחוליים, את ההשפעה של שינוי תזונתי, ואת ההשפעה של שינויים במצב פיסיולוגי 8. שימוש של GC כדי ללמוד דגימות במהלך ההריון סיפק חשובמידע על שינויים בחומצות שומן והומאוסטזיס שומנים מורכבים 3.
לקראת הפרדת chromatographic, שומנים המחולצים בדרך כלל מהמדגם באמצעות המסיסות של שומנים בתערובות ממיסים של כלורופורם ומתנול. נתרן כלורי הוא הוסיף כדי להקל על הפרדת התערובת לתוך שומנים מימיים ואורגניים המכילים שלבי 9,10. כיתות שומנים מורכבות של עניין ניתן להפריד בסך הכל תמצית שומנים בדם על ידי מיצוי שלב מוצק (SPE). טכניקת הפרדה זו elutes כיתות שומנים המבוססות על הקוטביות שלהם או זיקה מחייבת. Triacyglycerols (TAG) ואסטרים כולסטריל (CE) הם eluted הראשון כשבר משולבת, כיתות נוספות, phosphatidylcholine (PC), Phosphatidylethanolamine (PE), וחומצות שאינם esterified שומן (NEFA) הם eluted על ידי הגדלת הקוטביות של ממס משחררי . ההפרדה של TAG מהספירה מנצלת מחייבת של TAG רק למחסניות SPE טריותdge, המאפשר לספירה להיות eluted. TAG אז יכול להיות eluted על ידי הגדלת הקוטביות של 9,10 ממס משחררי. שיטה זו מאפשרת דגימות מרובות כדי להפריד בו זמנית עם תשואה גבוהה יותר מזו שהושגה עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה, מה שאומר שדגימות בגודל קטנות יחסית (למשל <פלזמה 100 μl או סרום, <רקמת מ"ג 100) ניתן לנתח 11,12.
GC הוא טכניקה מבוססת היטב תוארה לראשונה בשנת 1950s; הוצע כי השלב הנייד במערכות אז נוזל נוזל יכול להיות מוחלף עם אדים. בהתחלה זה היה בשימוש לניתוח נפט אך התרחב במהירות לתחומים אחרים כגון ניתוח חומצת אמינו וביוכימיה שומנים בדם, שהוא עדיין עניין גדול. התקדמות בציוד GC וטכנולוגיה, כגון הפיתוח של עמודות נימים מהשתמשו בעבר הטורים עמוסים הובילה לטכניקות הנוכחיות שלנו שבו חומצות שומן יכולות להיותנפרד בצורה יעילה יותר בטמפרטורות נמוכות יותר וכתוצאה מכך GC בשימוש באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת את חומצות שומן במגוון רחב של חקירות 13.
GC דורש חומצות שומן להיות derivatized על מנת שהם עשויים להיות תנודתי במידה מספקת כדי להיות eluted בטמפרטורות סבירות ללא פירוק תרמי. בדרך כלל הדבר כרוך ההחלפה של קבוצה פונקציונלית המכילה מימן ליצירת אסטרים, thioesters או אורגני חיבור לניתוח. אסטרים מתיל בדרך כלל נלמדים נגזרים, אשר מיוצרים על ידי מתילציה. בשיטה זו אג"ח אסתר בשומנים מורכבים הידרוליזה לשחרר חומצות שומן חופשיות, הtransmethylated כדי ליצור אסטרים מתילים של חומצות שומן (FAME). הפרופיל וכתוצאה מכך של תהילה, שנקבע על ידי GC, שמכונה הרכב חומצות שומן וניתן להשוות בקלות בין קבוצות ניסוי השונות 9,10. הטכניקה מאפשרת גם את הפרופורציות של אדם מסוים עלחומצות שומן רע"מ וריכוזיהם כדי להימדד.
בנוסף לשימוש של GC לניתוח חומצות שומן בלימודי תזונה ובתוך תעשיית המזון, הטכניקה יכולה לשמש במגוון רחב של תחומים אנליטיים. לדוגמא, ניתוח סביבתי באמצעות GC כולל מדידת זיהום מים על ידי חומרי הדברה ואדמה מנתחת מדידת תכולת chlorobenzene. בטוקסיקולוגיה, GC שימש גם לזיהוי חומרים לא חוקיים בשתן ודגימות של אנשים בדם; משפרי ביצועים כגון ספורט 12 ואת היכולת להפריד תערובות מורכבות של פחמימנים הופכים טכניקה זו פופולרית בתעשיית הנפט לניתוח פטרוכימי 12.
הריון קשור לשינויים משמעותיים בהרכב חומצות השומן של רקמות אימהיות, במיוחד בתוכן של אומגה 3 (n-3) ואומגה 6 (n-6) ACI שומן רב בלתי רוויDS (PUFA) 3. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את השימוש של GC במדידה של חומצות שומן על ידי המתאר את השימוש בו בניתוח של הרכב חומצות שומן של רקמת כבד שנלקחה מחולדות בתולה ובהריון קבלו תזונה דלת שומן וגבוהה עם מקורות נפט שונים. הדיאטות הניסיוניות הניתנות כאן היו דיאטת סויה דלת שומן על בסיס שמן, תזונה עתירה שומן סויה על בסיס שמן (סה"כ שומן סה"כ שומן / קילוגרם 130.9 ז) או דיאטה הבוסס על שמן פשתן עשיר בשומן (סה"כ שומן / קילוגרם 130.9 גרם דיאטה), ובלבד ל20 ימים. הרכב חומצות שומן התזונתי ומלא של דיאטות אלה תוארו בעבר 14. דיאטות שמן הסויה עשירות בחומצה לינולאית (18:02 n-6) ומכילות כמה חומצת α לינולנית (18:03 n-3) בזמן דיאטת שמן הפשתן עשירה בחומצה לינולנית α. תזונה עשירה בשומן אלה מייצגות מנות שונות של חומצות לינולאית לα לינולנית (מנות של 08:01 ו1:1, בהתאמה). השיטה לבידוד של כיתות שומנים בודדות וניתוח על ידי GC היא שאנחנוll הוקם ותוקף, וכבר פורסם בעבר 10 אך ללא התיאור הטכני מפורט מצא במסמך זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
גז כרומטוגרפיה היא טכניקה מדויקת לשימוש לניתוח חומצות שומן, והשחזור הגבוה שלו ימצא לטכניקה זו מתאימה לניתוחים קליניים. עמודות GC מתאימות חייבים להיות בשימוש על מנת לאפשר זיהוי של חומצות שומן של עניין, עם עמודות זמינות שיש וריאציות בקוטביות של השלב נייח, אורך עמודה וה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר בתרומתם של Meritxell רומאו-נדאל למחקר החולדה.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
