Использование газовой хроматографии для анализа изменения состава жирных кислот в ткани печени крыс во время беременности
Summary
Беременность приводит к значительным изменениям в составе жирных кислот материнских тканей. Профили липидов могут быть получены с помощью газовой хроматографии, чтобы идентификация и количественное определение жирных кислот в отдельных классов липидов среди крыс, которых кормили различные высокие и низкие жиров диеты во время беременности.
Abstract
Метод газовой хроматографии (ГХ) является высокочувствительным методом, используемым для идентификации и количественного содержания жирных кислот липидов из тканей, клеток и плазмы / сыворотки, дает свои результаты с высокой точностью и высокой воспроизводимости. В исследованиях метаболических и питания GC позволяет оценить изменения концентрации жирных кислот следующих мероприятий или во время изменений в физиологическом состоянии, как беременность. Добыча твердой фазы (SPE) с помощью аминопропил кремнезема картриджей позволяет разделение основных классов липидов, включая триацилглицеринов, различных фосфолипидов, и эфиров холестерина (CE). ГК в сочетании с SPE был использован для анализа изменений в составе жирных кислот СЕ фракции в печени целинных и крыс, которые были кормили различные высокие и низкие жиров диеты. Существуют значительные эффекты взаимодействия диета / беременность от содержания омега-3 и омега-6 жирных кислот печени CE, указывая, что беременные самки имеют различный ответ на диетического manipulatионный, чем видно среди девственных самок.
Introduction
Метод газовой хроматографии (ГХ) является устоявшихся метод, используемый для идентификации и количественного включение жирных кислот в липидные бассейнов и клеточных мембран 1,2 во добавок или физиологических условиях, таких как ожирение (и связанных с ним заболеваний, таких как диабет) или беременности 3 – 5. Он также подходит для анализа типов и количеств жиров в пищевых продуктах. Это полезно при характеристике экспериментальные диеты, а также обеспечение того, чтобы пищевой промышленности соответствует нормам. Например, ГК может быть использован для подтверждения личности и количество жирных кислот внутри продукта, таких как пищевая добавка для того, чтобы маркировка является правильным и правила будут соблюдаться 6,7. Анализ жирных кислот может обеспечить ценную информацию липидного обмена в норме и патологии, влияние изменения рациона питания, а также влияние изменений в физиологическом состоянии 8. Использование GC изучать образцы во время беременности оказывает важноеинформация об изменениях в жирной кислоты и сложного липидного гомеостаза 3.
В преддверии хроматографического разделения, липиды, как правило, извлекается из образца с помощью растворимости липидов в смеси растворителей хлороформ-метанол. Хлорида натрия, чтобы облегчить разделение смеси на водную и органическую фазы, содержащей липид 9,10. Сложные классы липидов интереса может быть отделен от общего липидного экстракта путем твердофазной экстракции (SPE). Этот метод разделения элюирует классы липидов на основе их полярности или аффинность связывания. Triacyglycerols (TAG) и сложные эфиры холестерина (CE), элюируют сначала в виде комбинированного фракции, еще классов, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (PE), и не этерифицированные жирные кислоты (NEFA), элюируют, увеличивая полярность элюирующего растворителя . Разделение TAG от CE использует связывание TAG только к свежим SPE патроныDGE, позволяя CE Элюируемый. TAG может быть затем элюировали путем увеличения полярность, элюируя 9,10 растворителя. Этот метод позволяет несколько образцов должны быть разделены одновременно с более высоким выходом, чем достигается при тонкослойной хроматографии, что означает, что относительно небольшие размеры образцов (например, <100 мкл плазмы или сыворотки, <100 мг ткани) могут быть проанализированы 11,12.
GC является хорошо отработанной технологией впервые описан в 1950; было предположено, что подвижная фаза в системах затем жидкость-жидкость может быть заменена с паром. Изначально он использовался для нефтяной анализа, но быстро расширяется в других областях, таких как аминокислотного анализа и липидов биохимии, которая по-прежнему большой интерес. Успехи в GC оборудования и технологий, таких как развитие капиллярных колонок из ранее использовавшихся упакованных колонках привело к наших текущих методов, в которых жирные кислоты способны бытьразделенных более эффективно при более низких температурах приводит к GC используется обычно для идентификации и количественного определения жирных кислот в широком диапазоне исследований 13.
GC требует жирные кислоты должны быть получены производные с тем, что они могут стать достаточно летучи, чтобы быть элюировали при разумных температурах без термического разложения. Это обычно включает замещение функциональной группы, содержащей водород с образованием сложных эфиров, сложные тиоэфиры или амиды для анализа. Метиловых эфиров обычно изучали производные, которые производятся путем метилирования. В этом методе сложноэфирные связи в сложных липидов гидролизуют, чтобы освободить свободные жирные кислоты, которые transmethylated с образованием метиловых эфиров жирных кислот (FAME). В результате профиль FAME, определяется GC, называют состава жирных кислот и могут быть легко по сравнению между различными экспериментальными группами 9,10. Методика позволяет обе пропорции отдельUAL жирные кислоты и их концентрации должны быть измерены.
В дополнение к использованию GC для анализа жирных кислот в питании исследований и в пищевой промышленности, методика может быть использована в широком диапазоне аналитических областей. Например, экологические анализы с использованием GC включают измерения загрязнения воды инсектицидами и почвы анализирует измерения содержания хлорбензол. В токсикологии, GC также используется для выявления запрещенных веществ в моче и образцах крови лиц; такие спортивный производительности усилители 12 и способность отделить сложные смеси углеводородов делает этот метод популярен в нефтяной промышленности для нефтехимической анализа 12.
Беременность связана со значительными изменениями в жирнокислотного состава материнской тканей, специально в содержании омега-3 (N-3) и омега-6 (п-6) полиненасыщенных жирных ациспуск (ПНЖК) 3. В текущем исследовании, мы иллюстрируют использование GC в измерении жирных кислот, описывая его использование в анализе состава жирных кислот ткани печени, взятой из целинных и беременных крыс кормили низкие и высоким содержанием жиров диеты с различными источниками нефти. Экспериментальные диеты, приведенные здесь были масляной основе диеты с низким содержанием жира сои, с высоким содержанием жиров на масляной основе диеты сои (130,9 г Всего жиров / кг жиров) или с высоким содержанием жиров на масляной основе диеты льняное (130,9 г Всего жиров / кг диета), при условии течение 20 дней. Состав кислота полный питательных веществ и жирных из этих диет были описаны ранее 14. Нефтяные диеты сои богаты линолевой кислоты (18:02 н-6) и содержат некоторое количество α-линоленовой кислоты (18:03 н-3), когда диета масло льняное богат α-линоленовой кислоты. Эти высоким содержанием жиров диеты представляют различные рационы линолевой к α-линоленовой кислот (рационах 8:01 и 1:1, соответственно). Метод выделения отдельных классов липидов и анализа ГХ, мыLL создана и утверждена, и был опубликован ранее 10, но без подробное техническое описание найденного здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Газовая хроматография является точным метод, используемый для анализа жирных кислот, и его высокая воспроизводимость считает эту технику, подходящую для клинических анализов. Соответствующие столбцы GC должен использоваться для того, чтобы идентифицировать жирных кислот, представля?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность за вклад Меритшелльская Роме-Надаль в исследовании на крысах.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
