Summary
Zwangerschap leidt tot belangrijke veranderingen in de vetzuursamenstelling van maternale weefsels. Lipidenprofiel kan worden verkregen via gaschromatografie van de identificatie en kwantificatie van vetzuren in individuele lipideklassen onder ratten verschillende hoge en lage vetgehalte diëten tijdens de zwangerschap.
Abstract
Gaschromatografie (GC) is een zeer gevoelige methode voor het vetzuurgehalte van lipiden identificeren en kwantificeren van weefsels, cellen en plasma / serum, waardoor resultaten met hoge nauwkeurigheid en hoge reproduceerbaarheid. Metabole en voeding studies laat GC beoordeling van veranderingen in vetzurenconcentraties volgende activiteiten of tijdens veranderingen in de fysiologische toestand, zoals zwangerschap. Vaste fase-extractie (SPE) met aminopropyl silica cartridge kan scheiding van grote lipide klassen waaronder triacylglycerolen, verschillende fosfolipiden en cholesteryl esters (CE). GC gecombineerd met SPE werd gebruikt om de veranderingen in vetzuursamenstelling van de CE-fractie in de levers van maagdelijke en zwangere ratten die waren gevoed verschillende hoge en lage vetgehalte diëten analyseren. Er zijn aanzienlijke dieet / zwangerschap interactie-effecten op de omega-3 en omega-6 vetzuren van lever CE, wat aangeeft dat zwangere vrouwen hebben een andere reactie op dieet manipulation dan wordt gezien bij maagdelijke vrouwtjes.
Introduction
Gaschromatografie (GC) is een gevestigde techniek voor de opname van vetzuren in aanvulling of fysiologische aandoeningen zoals obesitas (en verwante ziekten zoals diabetes) of zwangerschap 3 identificeren en kwantificeren in lipide zwembaden en celmembranen 1,2 - 5. Het is ook geschikt voor het analyseren van de soorten en hoeveelheden van vetten in voedingsmiddelen. Dit is handig wanneer het karakteriseren van experimentele diëten, alsmede ervoor te zorgen dat de voedingsindustrie voldoet aan regelgeving. Zo kunnen GC worden gebruikt om de identiteit en hoeveelheid van vetzuren in een product, zoals een voedingssupplement bevestigen zodat etikettering juist is en regels worden nageleefd 6,7. Analyse van vetzuren kan waardevolle inzichten in de vetstofwisseling in gezondheid en ziekte, de gevolgen van dieet te veranderen, en het effect van veranderingen in de fysiologische toestand 8 bieden. Gebruik van GC om monsters te bestuderen tijdens de zwangerschap is belangrijk verstrektinformatie over wijzigingen in vetzuur en complexe lipiden homeostase 3.
Voorafgaand aan de chromatografische scheiding, worden meestal lipiden geëxtraheerd uit het monster met de oplosbaarheid van lipiden in oplosmiddelmengsels van chloroform en methanol. Natriumchloride wordt toegevoegd om de scheiding van het mengsel in waterige en organische fasen lipide bevattende 9,10 vergemakkelijken. Complexe lipide klassen van belang kan uit het totale lipide extract gescheiden worden door vaste-fase-extractie (SPE). Deze scheidingstechniek spoelt lipide klassen op basis van hun polariteit of bindingsaffiniteit. Triacyglycerols (TAG) en cholesteryl esters (CE) eerst geëlueerd als een gecombineerde fractie verder klassen, fosfatidylcholine (PC), Fosfatidylethanolamine (PE) en niet-veresterde vetzuren (NEFA) worden geëlueerd door het verhogen van de polariteit van de loopvloeistof . De scheiding van TAG van CE maakt gebruik van de binding van TAG alleen voor een frisse SPE cartridgdge, waardoor CE worden geëlueerd. TAG kan vervolgens worden geëlueerd door het verhogen van de polariteit van het eluerende oplosmiddel 9,10. Deze methode maakt meerdere monsters tegelijkertijd worden gescheiden met een hogere opbrengst dan wordt bereikt met dunnelaagchromatografie, waardoor relatief klein formaat monsters (bijv. <100 gl plasma of serum, <100 mg weefsel) kunnen worden geanalyseerd 11,12.
GC is een gevestigde techniek voor het eerst beschreven in 1950, werd gesuggereerd dat de mobiele fase in het toen vloeistof-vloeistof systemen kunnen worden vervangen door stoom. Het werd aanvankelijk gebruikt voor de olie-analyse, maar snel uitgebreid naar andere gebieden, zoals aminozuur analyse en lipide biochemie, die nog steeds van groot belang. Vooruitgang in GC apparatuur en technologie, zoals de ontwikkeling van capillaire kolommen uit de eerder gebruikte gepakte kolommen heeft geleid tot de huidige technieken die vetzuren kunnen wordenefficiënter afgescheiden bij lagere temperaturen resulteert in GC wordt routinematig gebruikt om vetzuren in diverse onderzoeken 13 identificeren en te kwantificeren.
GC vereist vetzuren worden gederivatiseerd zodat zij voldoende vluchtig worden geëlueerd bij redelijke temperaturen zonder thermische ontleding kan worden. Meestal gaat de substitutie van een functionele groep die waterstof esters, thio-esters of amiden voor analyse vormen. Methylesters worden vaak bestudeerd derivaten die worden geproduceerd door methylering. In deze werkwijze de esterbindingen in complexe lipiden worden gehydrolyseerd tot vrije vetzuren, die transmethylated om vetzuurmethylesters (FAME) vormen loslaten. Het resulterende profiel van FAME, bepaald met GC, wordt aangeduid als de vetzuursamenstelling en kunnen gemakkelijk worden vergeleken tussen verschillende experimentele groepen 9,10. De techniek kan zowel de verhoudingen van indiUAL vetzuren en hun concentraties te meten.
Naast het gebruik van GC te analyseren vetzuren in de voeding studies en in de voedingsmiddelenindustrie kan de techniek worden gebruikt in diverse analytische velden. Bijvoorbeeld, milieu-analyses met behulp van GC omvatten het meten van verontreiniging van het water door insecticiden en bodemanalyses meten chlorobenzeen inhoud. In toxiciteitsstudies, is GC ook gebruikt om illegale stoffen in urine en bloedmonsters van personen te identificeren, dergelijke sportprestaties versterkers 12 en het vermogen om complexe mengsels van koolwaterstoffen te scheiden maakt deze techniek populair in de aardolie-industrie voor petrochemische analyse 12.
Zwangerschap wordt geassocieerd met significante veranderingen in de vetzuursamenstelling van maternale weefsels, met name in het gehalte aan omega-3 (n-3) en omega-6 (n-6) poly-onverzadigde vetzuren acids (PUFA) 3. In de huidige studie, illustreren wij het gebruik van GC in de meting van vetzuren door het beschrijven van het gebruik bij de analyse van de vetzuursamenstelling van leverweefsel genomen van ruwe en zwangere ratten laag en vetrijke diëten met verschillende oliebronnen. De experimentele diëten die hier waren een vetarm sojaolie gebaseerd dieet, een vetrijke soja-olie gebaseerde dieet (130,9 g totaal vet / kg totaal vet) of een vetrijke lijnzaad olie gebaseerde dieet (130,9 g totaal vet / kg dieet), voorzag in 20 dagen. De volledige voedingsstoffen en vetzuursamenstelling van deze diëten zijn eerder 14 beschreven. De sojaolie diëten rijk aan linolzuur (18:02 n-6) en bevatten enkele α-linoleenzuur (18:03 n-3) als de lijnolie dieet rijk aan α-linoleenzuur. Deze vetrijke diëten vertegenwoordigen verschillende rantsoenen linolzuur tot α-linoleenzuur (rantsoenen 8:01 en 1:01, respectievelijk). Werkwijze voor het isoleren van individuele lipideklassen en analyse door GC well vastgesteld en gevalideerd, en is eerder 10, maar zonder de gedetailleerde technische beschrijving gevonden hierin gepubliceerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Animal Procedures
- Alle dierlijke werkzaamheden moeten in overeenstemming met het Home Office Dieren (Wetenschappelijke Procedures) Act (1986) worden uitgevoerd.
- Mate Wistarratten 10 weken oud door monogame fokken jaar, en bevestig zwangerschap door de verschijning van een vaginale plug. Noteer dit als dag 1 van de dracht, en beginnen experimentele dieet. Voor maagdelijke vrouwtjes, huisvesten elke rat individueel, en beginnen experimentele dieet.
- Na het voeden van de experimentele diëten gedurende 20 dagen euthanize ratten CO 2 stikken gevolgd door cervicale dislocatie.
- Gebruik dissectie tang en schaar om de buikholte bloot uitsnijden en de lever door het snijden van de banden, waarbij de lever sluiten op het membraan, voorste wand van de buik, maag en duodenum. Was de lever in PBS en bevriezen in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C.
2. Voorbereiding van een Total vetextract 9
- Molecul toevoegenar zeven (in te vullen 1/10 van oplosmiddel container) om alle oplosmiddelen om 'droge' oplosmiddelen maken. Voer alle oplosmiddel werk in een zuurkast.
- Snijd ongeveer 100 mg bevroren lever en weeg. Plaats het weefsel in een buis in een ijsemmer en voeg 0,8 ml ijskoud 0,9% NaCl. Homogeniseren het weefsel.
- Voeg interne standaarden opgelost in 1 ml / mg droge chloroform: methanol (02:01, v / v) die gebutyleerd hydroxytolueen (BHT, 50 mg / l) als anti-oxidant. Voor 100 mg rattenlevers voeg 100 ug CE-norm (Cholesteryl heptadecanoate 17:00) Let op:. Chloroform en BHT zijn gevaarlijk.
- Voeg 5,0 ml droge chloroform: methanol (02:01, v / v) bevattende BHT (50 mg / L).
- Voeg 1,0 ml 1 M NaCl, meng goed door vortexen tot het mengsel ziet er uniform. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
- Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min, vanaf remmen kamertemperatuur.
- Verzamelen lagerfase met glazen Pasteur pipet nieuwe schroefdop glazen buis en droog onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
3. Scheiding van Lipid klassen door Solid Phase Extraction (SPE) 10
- Sluit de SPE tank met een vacuümpomp en plaats aminopropyl silica SPE cartridge in de tank.
- Plaats nieuwe schroefdop glazen buis gelabeld TAG en CE in de tank rack onder de kolom om eerste fractie te verzamelen.
- Los de totale lipide-extract in 1,0 ml droge chloroform en vortex.
- Solliciteer monster op de kolom met een glas Pasteur pipet en laat het door druppelen in de schroefdop buis onder zwaartekracht. Wanneer er geen verdere druppels vallen, verwijder de resterende vloeistof door vacuüm.
- Elueer het TAG en CE fractie onder vacuüm was de kolom met 2 x 1,0 ml wassen droog chloroform.
- Als alle vloeistof wordt verwijderd, droog de TAG en CE fracn onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
- Plaats nieuwe schroefdop glazen buis gelabeld PC in de lade tank onder de kolom.
- Elueer de PC fractie onder vacuüm onder toevoeging van 2 x 1,0 ml droge chloroform: methanol (60:40, v / v) totdat alle vloeistof uit de kolom verwijderd.
- Verwijder droge PC fractie onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
- Plaats een nieuwe schroefdop glasbuis benaming PE in de tank lade en elueer PE fractie onder toevoeging van 1,0 ml droge methanol onder vacuüm.
- Verwijder droge PE fractie onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
- Plaats nieuwe schroefdop glasbuis gelabeld NEFA in de tank lade en elueer NEFA fractie onder vacuüm door toevoeging van 2 x 1,0 ml wassingen droge chloroform: methanol: ijsazijn. (100:2:2, v / v / v) Let op: IJsazijn is gevaarlijk.
- Verwijder de verzamelde NEFA fractie en droog onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
- Plaats een nieuwe aminopropylsilicagel SPE-patroon op de SPE tank en plaats een schroefdop glazen buis in de tank bak onder de cartridge om afval op te halen.
- Was de kolom met 3 wasbeurten van droge hexaan onder vacuüm en vervolgens een laatste 1,0 ml wasbeurt onder zwaartekracht. Sta niet toe dat de cartridge droog worden (draai de kolom cartridge kanalen naar een gesloten positie wanneer hexaan niveau ligt dicht bij de cartridge matrix). Let op: Hexaan is gevaarlijk.
- Vervang afval buis met nieuwe schroefdop glazen buis label CE.
- Los de droge TAG en CE fractie (bereid in stap 3,6) in 1,0 ml droog hexaan en vortex. Breng dit aan de kolom met behulp van een glas Pasteur pipet en laat het door een plasje water onder gravity.
- Wanneer er geen verdere druppels vallen, verwijder de resterende vloeistof onder vacuüm.
- Onder vacuüm was de kolom met 2 x 1,0 ml wassen droog hexaan CE en droge opgevangen fractie geëlueerd onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
- Plaats nieuwe schroefdop glazen buis label TAG in de lade tank en elueren TAG met de toevoeging van 2 x 1,0 ml wasbeurten droge hexaan: methanol: ethylacetaat (100:5:5) onder vacuüm.
- Droog opgevangen fractie onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week. Let op: Ethylacetaat is gevaarlijk.
4. Voorbereiding van FAME van CE 10
- Voeg 0,5 ml droge tolueen aan de gescheiden CE-fractie (in stap 3.19 verzameld) en vortex. Let op: Tolueen is gevaarlijk.
- Bereid methyleringsreagens (droge methanol met 2% (v/ V) H 2 SO 4), waarvan 1,0 ml nodig per monster. Doseer volume droge methanol in glas of geschikte kunststof container met deksel en voeg de benodigde hoeveelheid H 2 SO 4 druppelsgewijs en meng door omkeren. Let op: Zwavelzuur is gevaarlijk.
- Voeg 1,0 ml van het methyleringsmiddel het opgelost in droge tolueen monsters cap de buizen veilig en meng voorzichtig.
- Verwarm de monsters gedurende 2 uur bij 50 ° C.
- Na 2 uur verwijderen buizen van het vuur. Zodra koele voegen 1,0 ml neutraliserende oplossing (0,25 M KHCO3 0.5mK 2 CO 3) Let op:. Kaliumbicarbonaat en kaliumcarbonaat zijn gevaarlijk.
- Voeg 1,0 ml droge hexaan en vortex.
- Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 minuten, vanaf remmen kamertemperatuur.
- Verzamel bovenste fase, waarin de FAME bevat, en over in een nieuwe niet schroefdop wegwerp glazen buis.
- Droog de verzamelde FAME onderstikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
5. Verwijdering van gratis Cholesterol Verontreiniging door CE FAME 14
(Gratis cholesterol kan het monster besmetten; zie figuur 1 bijvoorbeeld gaschromatograaf sporen met en zonder vrije cholesterol te verwijderen).
- Plaats een afval buis in SPE tank en plaats een silicagel SPE-patroon op de tank.
- Waskolom met 3 x 1 ml wasbeurten droog hexaan onder vacuüm en 1 x 1 ml onder zwaartekracht.
- Verwijder afval wast en voeg nieuwe afval buis in de tank.
- Ontbinden CE FAME in 1 ml droge hexaan, vortex.
- Breng de kolom onder toepassing van een glazen Pasteur pipet en doorlaten druppelt onder zwaartekracht.
- Waskolom met 3 x 1 ml wasbeurten van hexaan onder vacuüm.
- Verwijder afval wast en plaatst nieuwe niet schroefdop buis in de tank label CE FAME.
- Elueren deCE FAME met 2 x 1 ml droge hexaan: diethylether (95:5 v / v) wasbeurten.
- Droog onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week. Let op: Diethyl ether is gevaarlijk.
6. Overdracht van FAME in GC Auto Sampler Vial
- Voeg 75 ul droog hexaan om te proeven, vortex, en over te dragen aan een GC auto monsterflesje.
- Voeg een verdere 75 pl droog hexaan om te proeven, vortex en transfer naar dezelfde GC auto monster flesje. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een maand.
7. Analyse met behulp van de gaschromatograaf 14
- Analyseer FAME op een gaschromatograaf. Voorbeeld opgezet: 30 mx 0,25 micrometer x 0.25 mm BPX-70 fused silica capillaire kolom met de temperatuur protocol:
Begintemperatuur 115 ° C, bezit 2 min, helling 10 ° C / min tot 200 ° C, houdt 18,5 min, helling 60 ° C / min tot 245 ° C, houd 4 min.
Column: Helium gas, debiet 1,0, druk 14.6 en snelheid 29.
Injector: Temperatuur = 300 ° C.
Detector: Waterstof stroom 40.0, luchtstroom 184.0, make-up gas Helium, stromen 45.0, temperatuur = 300 ° C. - Stel splitsingsverhouding zo nodig (bv. 25:1 voor CE FAME-analyse).
- Bepaal het oppervlak onder elke piek met behulp van de juiste software en identificeren van FAME in vergelijking met normen. Zie Figuur 2 bijvoorbeeld chromatogrammen.
- Gebruik het oppervlak van de piek gegevens aan de bijdrage van individuele vetzuren als percentage van de totale vetzuren berekenen.
- Bereken absolute concentraties van vetzuren door het gebied van de interne standaard te delen door de hoeveelheid toegevoegd. Verdeel het gebied van elk vetzuur van dit resultaat absolute concentraties van elk vetzuur in de hoeveelheid gebruikte weefsel vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succes van deze werkwijze afhankelijk volgens het protocol nauwkeurig en met schoon oplosmiddelen en reagentia om ruis en verontreinigingen die kunnen optreden op een chromatogram verminderen. Vervuilde monsters zijn uitdagender om te analyseren, het verlagen van de juistheid van de oppervlakte onder de curve berekeningen. Als het protocol succes volgt een chromatogram met duidelijke symmetrische, goed gedefinieerde pieken en met minimale achtergrondruis te worden verkregen zoals weergegeven in figuur 3. Als besmetting, het chromatogram worden extra pieken zien en vertonen asymmetrische (scheve) pieken zoals geïllustreerd in figuur 4. Verontreiniging door vrije cholesterol plaatsvinden bij het uitvoeren FAME afgeleid van CE (zie figuur 1, tenzij de cholesterol wordt verwijderd (zoals beschreven in protocol 5).
Het gebruik van een voorbereide kalibratie mix maakt de identificatie van de FAME in the monster. De kalibratie mengsel wordt uitgevoerd met dezelfde instellingen instrument monsters zodat het chromatogram kan worden vergeleken met het monster en pieken correct geïdentificeerd op basis van hun retentietijden zoals geïllustreerd in figuur 2.
Piekoppervlak wordt gebruikt om het percentage van specifieke vetzuren in de totale berekening. Zodra de gegevens zijn verzameld, is het nuttig te inspecteren op uitschieters zoals getoond in figuur 5. Uitschieter monsters kunnen vervolgens verder worden onderzocht en de extractie en / of analyses herhaald indien nodig.
Een interne standaard monsters (zoals beschreven in protocol stap 2.3) toevoegen maakt de kwantificering van vetzuren in het monster door berekeningen met het gebied van bekende hoeveelheid interne standaard piek ten opzichte van het oppervlak van de piek van belang en gecorrigeerd voor de oorspronkelijke monster volume of gewicht. In Tabel 1, FAME in rattenlever CE beschreven alsprocent van de totale vetzuren (g/100 g totaal vetzuur) in lever CE. Deze gegevens beschrijven de CE-vetzuren in de lever van de maagd of drachtige ratten die gedurende 20 dagen op een van drie verschillende diëten. Statistische analyse met twee-factor ANOVA (factoren: voeding, zwangere vs maagdelijke) onthult significante effecten van voeding en zwangerschap op het aantal verschillende vetzuren, en aanzienlijke dieet x zwangerschap interactie (tabel 1). Ter illustratie, Figuur 6 toont dat het arachidonzuur (AA, 20:04 n-6) gehalte lever CE zwangere ratten meer wordt beïnvloed door dieet dan maagdelijke vrouwtjes.
Figuur 1. Vergelijkende gaschromatogrammen van identieke monsters illustreren het belang van vrije cholesterol verwijdering in de rat leverweefsel. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Voorbeeld van de methode die wordt gebruikt om monster CE FAME identificeren van de rat leverweefsel met behulp van een geprepareerde kalibratie mix. Een prepared kalibratie mengsel wordt uitgevoerd met dezelfde instellingen instrument monsters zodat de chromatogrammen kan worden vergeleken vetzuren te identificeren binnen het monster. De begeleidende chromatogram voor de kalibratie mix maakt de FAME in de mix te worden geëtiketteerd. Dit label trace kan dan worden vergeleken met het chromatogram van het monster waar gemakkelijk identificeerbaar grote pieken kan worden vergeleken door hun retentietijden met die op de kalibratie mix vervolgens adequaat geëtiketteerd. Bijvoorbeeld gemarkeerd op het spoor. is 16:00 de vergelijking van de retentietijden van de kalibratie mix hierboven om de vetzuren in het monster hieronder spoor waardoor een correcte etikettering van vetzuren illustreren. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Voorbeeld van een verontreinigde NEFA gas chromatogram verkregen uit menselijk plasma. Er zijn vele onverwachte pieken, omcirkeld in het begin van het monster, die de integratie van echte pieken kan beïnvloeden. De pieken worden onderbroken en ongedefinieerde gezien towar ds het einde van het monster en zijn schuine geworden als omcirkeld. Dit zal de nauwkeurigheid van het gebied aantasten onder de curve berekeningen en de kwantificering van deze vetzuren. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. Identificatie van uitschieters gegevens tussen vetzuursamenstelling van lever CE in maagdelijke ratten gevoed met een vetrijk dieet sojaolie (n = 6). Dit illustreert hoe percentage data geanalyseerde vetzuren kunnen worden gebruikt om dubbelzinnige resultaten bepalen. Deze gegevens geven aan dat monster 125 uitbijter zijn, en vereist verder onderzoek. De vijf belangrijkste vetzuren in CE (16:00, 18:00, 18:01 n-9, 18:02 n-6, 20:04 n-6) wordt niet getoond.. Jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 6. Arachidonzuur inhoud van lever CE onder maagd en zwangere ratten gevoed experimentele diëten. Waarden zijn gemiddelden ± SD, n = 6. Betekent zonder een gemeenschappelijke brief verschillen, P <0,05. * Verschillend van maagdelijke vrouwtjes binnen dieet overeenkomende groep, P <0,05. Dit is een visuele weergave van de resultaten uit tabel 1 dat de verschillen in lever CE inhoud van maagdelijke ratten die verschillende diëten opzichte drachtige ratten diezelfde diëten. Verschillen zijn te zien in elke groep de voeding tussen de maagd en zwangere ratten. Klik hier voor grotere afbeelding.
Tabel 1. Vetzuursamenstelling van rat lever cholesterylesters van maagd en zwangere ratten gevoed experimentele diëten. Waarden zijn gemiddelden (SD), n = 6. ND geeft niet gedetecteerd (gemiddeld <0,1%). Betekent zonder een gemeenschappelijke brief binnen maagd of zwangere vrouwtjes verschillen, P <0,05. * Verschillend van maagdelijke vrouwtjes binnen dieet overeenkomende groep, P <0,05. Deze tabel toont de gemiddelde waarden van n-3 en n-6-vetzuren aanwezig in het leverweefsel van maagd en zwangere ratten bij toediening lage en wisselende vetrijke diëten. De resultaten werden statistisch geanalyseerd met behulp van variantie-analyse (ANOVA) met een significantie niveau van p <0,05 voor verschillen tussen virgin en zwangere ratten, de aard van de voeding en dieet x zwangerschap interactie. ANOVA resultaten suggereren dat er significante verschillen in de niveaus van arachidonzuur (20:4 n-6) tussen virgin en zwangere ratten binnen matched dieet groepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gaschromatografie is een nauwkeurige techniek te gebruiken voor vetzuuranalyse en de hoge reproduceerbaarheid acht deze techniek in klinische analyses. Geschikte GC kolommen worden gebruikt voor identificatie van vetzuren plaats mogelijk, met beschikbare kolommen met variaties in de polariteit van de stationaire fase, kolomlengte en binnendiameter. Het gebruik van een gesmolten silica capillaire kolom in deze analysemethode biedt goede thermische stabiliteit en een hoge reproduceerbaarheid van de retentietijden door zijn hoge oppervlakte inertheid en goede resolutie 8.
Kritische stappen in dit protocol zijn onder andere lagere en collectie stappen bovenste fase (protocol stappen 2.7 en 4.8). Het is belangrijk dat zoveel mogelijk van de juiste fase wordt verzameld mogelijk zonder verontreiniging met een van de ongewenste fase. De aanwezigheid van verontreinigingen in een monster resulteert in een ongewenste chromatografische uitgang, Zoals geïllustreerd in figuur 2. Bij het verzamelen CE tijdens SPE is het noodzakelijk dat de cartridge kolom verzadigd met oplosmiddel (stap 3.15) na het wassen met hexaan verzekeren het monster dringt de kolom succesvolle scheiding van CE van TAG mogelijk worden gehouden. De verdere scheiding van CE aan vrije cholesterol te verwijderen is belangrijk om besmetting die op chromatograaf sporen voorkomen zoals weergegeven in figuur 1. Het is eveneens belangrijk stappen ter verwijdering van vloeistof onder vacuüm gevolgd juist om alle vloeistof volledig uit de kolom verwijderd om een goede opbrengst te garanderen.
De belangrijkste beperking van GC is dat complexe lipiden zoals fosfolipiden en triacyglycerols moeten vóór derivatisering om FAME te vormen voorafgaand aan de analyse worden verzeept, zodat informatie over de specifieke structuur van deze lipiden en typische combinaties van vetzuren verloren 10. Alle stappen inDit protocol dient in een zuurkast door het gebruik van oplosmiddelen, die de geschiktheid omgeving deze werkwijze kan worden uitgevoerd in deze werkwijze beperkt uitgevoerd kan ook tijdrovend voor het analyseren van een klein aantal monsters, meestal waarbij twee werkdagen om van monster van belang gegevensuitvoer, tenzij volledig geautomatiseerde procedures worden gebruikt. Echter, bij het verwerken van grote aantallen monsters, elke fase kan tegelijk bij tijd doeltreffendheid van deze techniek en de beschikbaarheid van apparatuur maximaliseren andere gebruikers. Bepaalde technieken binnen het protocol vereist oefening en handvaardigheid zoals bovenste en onderste fase extracties (stappen 2.7 en 4.8), dat kan een probleem zijn voor mensen met problematische gewrichten of die gevoelig zijn voor negatieve effecten van repeterende bewegingen.
Stappen op deze wijze gemakkelijk worden toegevoegd of verwijderd om de verzameling van verschillende fracties vergemakkelijking van uiteenlopende monsters, bijvoorbeeld PE-collectie mogelijk niet vereist bij het analyseren van plasma, maar van belang is in de cel-en weefselmonsters 10. Deze werkwijze kan ook worden aangepast voor de analyse van cellen van de totale lipide extracten, waar de SPE stappen kunnen worden weggelaten indien gewenst. Een dergelijke variatie is die beschreven voor rode bloedcellen, die de totale lipide extractie stap weggelaten en SPE stap 15. In tegenstelling tot het huidige protocol, de methode die in deze studie gebruikt 250 ui van een methyleringsmiddel (14% boriumtrifluoride), die direct wordt toegevoegd aan rode cellen met 250 ul hexaan en gedurende 10 minuten bij 100 ˚ C. De neutralisatie stap weggelaten en in plaats daarvan water en hexaan toegevoegd, het monster wordt vervolgens gecentrifugeerd en hexaan bovenste fase verzameld en direct in een GC autosampler flesje overgebracht zonder drogen onder stikstof en opnieuw oplossen in hexaan.
GC is een veelzijdige werkwijze en verschaft reliable resultaten met een reeks beschikbare modificaties 15 en kan worden gebruikt om een groot aantal monsters geanalyseerd. Het heeft voordelen boven massaspectrometrie (MS) bij de analyse van n-6 en n-3 vetzuur metabolisme als het kan onderscheiden structureel vergelijkbare vetzuren gebruikt retentietijd etikettering tegenover atoommassa. MS is in staat om vetzuren te identificeren binnen een monster, maar niet in staat om dubbele binding posities in stereo te onderscheiden en daarom niet in staat om bepaalde vetzuren uit elkaar te houden. Desgewenst kunnen beide methoden samen worden door GC-MS 16. Deze techniek wordt toegepast bij onderzoek naar lipide metabolisme en functie in het gebied van lipidomics. Het gebruik van GC in combinatie met MS heeft geleid tot grote vooruitgang als het laat manipulatie van vetzuur identificatie door gebruik van verschillende stationaire fasen in GC onderscheid te maken tussen vetzuren die MS alleen niet kan. GC kan ook worden gebruikt in combinatie met electron massaspectrometrie(EI-MS), waardoor identificatie van vetzuren wanneer ze worden gecombineerd met andere chemische derivaten zoals esters picolinyl. Dit vergroot het gebruik van de techniek en blijft lipide profilering als onderzoeksmethode in een aantal gebieden, zoals de fysiologie, klinische biomarker detectie, en pathologie, evenals Lipidenbiochemie 17 verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de bijdrage van Meritxell Romeu-Nadal aan de studie rat erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P.
- Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
