Användning av gaskromatografi för att analysera förändringar av sammansättningen av fettsyror i råttlevervävnad under graviditeten

Summary

Graviditet leder till betydande förändringar av sammansättningen av fettsyror i moderns vävnader. Lipidprofiler kan erhållas via gaskromatografi för att möjliggöra identifiering och kvantifiering av fettsyror i enskilda lipidklasser bland råttor matade olika hög och fettsnål kost under graviditeten.

Abstract

Gaskromatografi (GC) är en mycket känslig metod som används för att identifiera och kvantifiera halten av lipider fettsyran från vävnader, celler och plasma / serum, vilket gav resultat med hög noggrannhet och hög reproducerbarhet. I metabola och näring studier tillåter GC bedömning av förändringar i fettsyrakoncentrationer följande insatser eller under förändringar i fysiologiska tillstånd som graviditet. Fast fas extraktion (SPE) med aminopropyl kiseldioxid kassetter möjliggör separation av de stora lipidklasser inklusive triacylglyceroler, olika fosfolipider och kolesterylestrar (CE). GC i kombination med SPE användes för att analysera förändringar i fettsyrasammansättningen av CE-fraktionen i levern hos jungfru och dräktiga råttor som matats olika höga och fettsnål kost. Det finns betydande kost / graviditet interaktionseffekter vid halt av lever CE yran omega-3 och omega-6 fettsyror, vilket tyder på att gravida kvinnor har en annan reaktion på kost manipulatjon än ses bland jungfru honor.

Introduction

Gaskromatografi (GC) är en väletablerad teknik som används för att identifiera och kvantifiera inkorporeringen av fettsyror i fett pooler och cellmembran ^1,2 under tillskott eller fysiologiska tillstånd som fetma (och relaterade sjukdomar som diabetes) eller graviditet ^{3 – 5.} Den är också lämplig för att analysera vilka typer och mängder av fett i livsmedel. Detta är användbart när karakterisera experimentella dieter, samt att se till att livsmedelsindustrin är förenligt med reglerna. Till exempel, kan GC användas för att bekräfta identiteten och mängden av fettsyror i en produkt som ett kosttillskott för att se till att märkningen är korrekt och bestämmelser efterlevs ^6,7. Analys av fettsyror kan ge värdefulla insikter i lipidmetabolismen i hälsa och sjukdom, inverkan av kostomläggningen, och effekten av förändringar i fysiologiska tillstånd ^8. Användning av GC för att studera prover under graviditeten har gett viktigainformation om förändringar i fettsyror och komplexa lipidhomeostas ^3.

I god tid före den kromatografiska separationen, är lipider vanligen extraheras från provet med användning av lösligheten av lipider i lösningsmedels blandningar av kloroform och metanol. Natriumklorid tillsättes för att underlätta separation av blandningen i vattenhaltig och organisk lipid som innehåller faser ^9,10. Komplexa lipidklasser av intresse kan separeras från det totala lipidextraktet genom fastfas-extraktion (SPE). Denna separationsteknik eluerar lipid klasser baserat på deras polaritet eller affinitet. Triacyglycerols (TAG) och kolesterylestrar (CE) eluerades först som en kombinerad fraktion, ytterligare klasser, fosfatidylkolin (PC), är fosfatidyletanolamin (PE), och icke-förestrade fettsyror (NEFA) elueras genom ökning av polariteten av elueringsmedlet . Separationen av TAG från CE utnyttjar bindning av TAG till endast en färsk SPE cartriDGE, vilket gör CE som elueras. TAG kan därefter elueras genom att öka polariteten av elueringslösningsmedel ^9,10. Denna metod gör det möjligt för flera prov som skall separeras samtidigt med ett högre utbyte än vad som uppnås med tunnskiktskromatografi, vilket betyder att relativt små och medelstora prover (t ex <100 | il plasma eller serum, <100 mg vävnad) kan analyseras ^11,12.

GC är en väletablerad teknik som först beskrevs på 1950-talet, det föreslogs att den mobila fasen i den då vätske-vätske system skulle kunna ersättas med ånga. Den användes ursprungligen för olja analys men snabbt expanderat till andra områden såsom aminosyraanalys och lipid biokemi, som fortfarande är av stort intresse. Framsteg inom GC utrustning och teknik som utveckling av kapillärkolonner från de tidigare använda packade kolonner har lett till att våra nuvarande tekniker i vilka fettsyror har möjlighet att varasepareras mer effektivt vid lägre temperaturer resulterar i GC som rutinmässigt används för att identifiera och kvantifiera-fettsyror i en mängd olika undersökningar ^13.

GC kräver fettsyror som derivatiseras så att de kan bli tillräckligt flyktig för att elueras vid rimliga temperaturer utan termisk nedbrytning. Detta innebär vanligtvis substitutionen av en funktionell grupp, som innehåller väte för att bilda estrar, tioestrar eller amider för analys. Metylestrar är allmänt studerade derivat, som produceras genom metylering. I denna metod esterbindningarna i komplexa lipiderna hydrolyseras för att frigöra de fria fettsyrorna, vilka transmethylated att bilda fettsyrametylestrar (FAME). Den resulterande profilen för FAME, bestämd med GC, benämnes fettsyrakompositionen och kan lätt jämföras mellan olika försöksgrupper ^9,10. Tekniken tillåter både proportionerna av individella fettsyror och deras koncentrationer som skall mätas.

Förutom användning av GC för att analysera fettsyror i näringsstudier och inom livsmedelsindustrin, kan tekniken användas inom ett brett spektrum av analytiska områden. Till exempel innefattar miljöanalyser som använder GC mäter vattenförorening av insekts-och jordanalyser mäter klorhalt. I toxikologi, har GC också använts för att identifiera illegala substanser i urin-och blodprov av individer, en sådan sport prestationshöjande medel ¹² och förmågan att separera komplexa blandningar av kolväten gör denna teknik populär inom oljeindustrin för petrokemisk analys ^12.

Graviditet är förknippad med betydande förändringar av fettsyresammansättningen av moderns vävnader, särskilt i innehållet av omega-3 (n-3) och omega-6 (n-6) fleromättade fettsyror ACIds (PUFA) ^3. I den aktuella studien, exemplifierar vi användning av GC i mätningen av fettsyror genom att beskriva dess användning vid analys av fettsyrasammansättningen i levervävnad tas från jungfrulig och dräktiga råttor som utfodrats med låg-och fettrik kost med olika oljekällor. De experimentella dieter som här var en låg fetthalt sojaolja baserad kost, en fettrik sojaolja baserad kost (130,9 g totalt fett / kg totalt fett) eller en fettrik linolja baserad kost (130,9 g totalt fett / kg diet), anges 20 dagar. Den fullständiga näringsämne och fettsyrasammansättningen av dessa dieter har beskrivits tidigare ^14. Sojabönoljan dieter är rika på linolsyra (18:2 n-6) och innehåller en del α-linolensyra (18:3 n-3), medan linolja diet är rik på α-linolensyra. Dessa fettrik kost representerar olika ransoner av linolsyra till α-linolensyra (ransoner av 08:01 och 01:01, respektive). Metoden för isolering av enskilda lipid klasser och analys med GC är vill etablerade och validerade, och har tidigare ¹⁰ men utan detaljerad teknisk beskrivning hittas här publiceras.

Protocol

1. Djurförsök Alla djur arbete bör utföras i enlighet med de Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986). Mate Wistar-råttor i åldern 10 veckor gamla genom monogamt uppfödning, och bekräfta graviditeten genom uppkomsten av en vaginalplugg. Spela detta som dag 1 i dräktigheten, och börja experimentell diet. För jungfru honor, hysa varje råtta för sig, och börja experimentell diet. Efter att mata de experimentella dieter för 20 dagar avliva råttorna genom kvävning…

Representative Results

Framgången för denna metod är beroende av att följa protokollet exakt och på att använda rena lösningsmedel och reagens för att reducera "brus" och föroreningar som kan finnas på ett kromatogram. Förorenade prov är svårare att analysera, sänka riktigheten av området under kurvan beräkningarna. Om protokollet är framgångsrikt följt ett kromatogram med tydliga symmetriska, väldefinierade toppar och med minimalt bakgrundsljud ska erhållas som illustreras i figur 3. Om kontami…

Discussion

Gaskromatografi är en exakt teknik att använda för fettsyraanalys, och dess höga reproducerbarhet anser denna teknik är lämplig för kliniska analyser. Lämpliga GC kolonner måste användas för att möjliggöra identifiering av fettsyror av intresse, med tillgängliga kolumner som har variationer i polariteten av den stationära fasen, kolumn längd och innerdiameter. Användningen av en kapillärkolonn av kvarts i denna analysmetod ger god termisk stabilitet och hög reproducerbarhet av retentionstiderna på gr…

Materials

Methanol:	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Chloroform:	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
BHT:	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns – 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns – 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas – explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge – Bead mass 100mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge – Bead mass 100mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6mm
Glass pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251
Borosilicate glass test tube	Fisher Scientific	FB59527	Non-screw cap
Screw thread glass test tubes	Fisher Scientific	FB59555	13mm
Caps for screw thread test tubes	Fisher Scientific	FB51353	To fit 13mm tube
Solida phase extraction (SPE) tank	Agilent		VacElut 20 Manifold
Luer stopcocks for SPE tank	Agilent	12131005
Vacuum pump	Sigma- Aldrich	2656-194GB-1EA
GC vials	Kinesis	STV 12-03TS	Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert
GC vial lids	Kinesis	SCC09-0.2B	Short thread 9mm blue
GC inlet liners	SGE Analytical science	092002	Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm
GC septa	SGE Analytical science	041856	11mm, MN material
GC column	SGE Analytical science	054612	Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm
Gas chromatograph			HP 6890 series