Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines
Summary
Notre rapport décrit une méthode unique pour visualiser et analyser les interactions CTC / CE dans le cancer de la prostate dans des conditions d'écoulement physiologiques.
Abstract
La métastase est un processus dans lequel les cellules tumorales perdent de la tumeur primaire intravasate vasculaire sanguin et du système lymphatique, de ce fait, l'accès à s'extravaser et former un créneau secondaire. L'extravasation de cellules tumorales à partir du système vasculaire sanguin peut être étudiée en utilisant des cellules endotheliales (EC) et des cellules tumorales obtenues à partir de différentes lignées cellulaires. Les premières études ont été menées dans des conditions statiques, mais il a été bien documenté que les CE se comporter différemment dans des conditions d'écoulement physiologiques. Par conséquent, les différents ensembles de chambre de débit sont actuellement utilisés pour l'étude des interactions de cellules cancéreuses avec les EC. Ensembles de chambre de flux actuels offrent des résultats reproductibles en utilisant soit des lignées cellulaires différentes ou de fluide à différentes conditions de stress de cisaillement. Toutefois, à observer et à étudier les interactions avec les cellules rares telles que des cellules tumorales circulantes (CTC), certaines modifications doivent être apportées à l'ensemble de la chambre de flux classique. CTCsont une population de cellules rares parmi des millions de cellules sanguines. Par conséquent, il est difficile d'obtenir une population pure de CTC. Contamination des CTC avec différents types de cellules qui se trouvent normalement dans la circulation est inévitable en utilisant enrichissement présents ou techniques d'épuisement. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode unique de cellules de cancer de la prostate par fluorescence de l'étiquette de circulation et d'étudier leurs interactions avec les CE dans un système de chambre de circulation auto-assemblée. Cette technique peut être en outre appliqué à observer les interactions entre les CTC de la prostate et de toute protéine d'intérêt.
Introduction
Métastase est un processus complexe en plusieurs étapes qui reste mal compris. L'axe de ligand E-selectin/selectin a été montré pour jouer un rôle important dans la métastase de la tumeur en favorisant les interactions adhésives primaires entre l'endothélium vasculaire et les cellules cancéreuses 1,2. Endothéliale (E)-sélectine est une protéine transmembranaire exprimée par les cellules endothéliales activées, tandis que les différents ligand (s) E-sélectine est exprimée par les cellules tumorales 3. De nombreuses approches in vitro ont été utilisés avec succès pour modéliser les interactions de ligands E-selectin/selectin entre les cellules tumorales et les cellules endotheliales (EC) 1. Pour étudier ces interactions, les différents systèmes de chambres d'écoulement sont utilisées pour simuler le système vasculaire sanguin. Parmi les ensembles de la chambre d'écoulement, la chambre d'écoulement à plaques parallèles (FPNC), en liaison avec les EC est couramment utilisé comme modèle in vitro simulant vivo dans des conditions de contrainte de cisaillement. Dans ceProcédé, les EC sont cultivées sur une boîte de 35 mm, et après la réalisation d'une monocouche, les EC sont fixés à la FPNC et expériences basées contrainte de cisaillement sont effectuées.
Cependant, PPFC et autres systèmes actuels présentent de nombreuses limites à l'étude des interactions adhésives entre les cellules tumorales circulantes (CTC) provenant de patients et EC, principalement parce que les CTC sont une population rare de cellules, remise de la tumeur primaire, circulant parmi des millions de cellules sanguines (1 CTC par 10 9 cellules sanguines) 4. Ainsi, contrairement à l'offre illimitée de lignées cellulaires en culture, un faible nombre de CTC conduisent à très peu et rares interactions CTC / CE, nécessitant la bonne largeur de canal d'écoulement d'enregistrer les interactions pour l'analyse de la lecture. En outre, depuis patients CTC dérivés sont une population impur, donc un marqueur d'identification est nécessaire pour suivre les CTC en particulier. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle méthode pour identifier le cancer de la prostate (CaP) CTCs en profitant du fait que la quasi-totalité de ces CTC expriment l'antigène de membrane spécifique de la prostate (PSMA) sur leur surface cellulaire 5,6. Dans ce rapport, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cancer de la prostate, MDA PCa2b (MDA), afin de démontrer l'utilité potentielle de notre nouveau système à étudier la prostate interactions CCT avec les CE, finalement à comprendre le mécanisme de métastases.
Notre méthodologie peut être appliquée à diverses expériences de cisaillement en fonction de simulation dans le système vasculaire in vivo 7-9. Outre l'examen des interactions PCa CTC / CE, le système de chambre de passage du courant pourrait être facilement adapté pour l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique ou des interactions des cellules tumorales avec les EC. La facilité de démontage et remontage de la chambre d'écoulement, une microplaque III (0,1) (ci-après dénommé microlame), permet la culture EC sous perfusion et stimulant EC avec différentes cytokines pour induire protein expression. En outre, les EC cultivées, des protéines recombinantes telles que E-et P-sélectine peuvent être revêtus sur la microplaque et les interactions avec les cellules tumorales peut être observé dans des conditions d'écoulement laminaire 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison du faible nombre de CTC parmi les cellules sanguines, il est difficile d'isoler les CTC comme une population pure de cellules. Afin d'étudier les interactions CTC / CE, la population rare et impure de CTC pose deux défis majeurs: a) Identification des CTC entre les cellules du sang; b) Observation des interactions CTC / CE.
Pour remédier à la première limitation d'identifier les CTC de la prostate chez les cellules du sang, nous avons pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement du ministère de la Défense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 de l'Institut national du cancer, et le Fonds de recherche Robert McCooey génito-urinaire oncologie. Nous tenons à remercier le Dr Annarita Lorenzo (Département de pathologie) pour fournir des anticorps VE-cadhérine, et le Dr Marco Seandel (département de chirurgie) pour fournir HUVEC.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
