Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane
Summary
Il nostro rapporto descrive un metodo unico per visualizzare e analizzare le interazioni CTC / CE del cancro della prostata in condizioni di flusso fisiologiche.
Abstract
La metastasi è un processo in cui le cellule tumorali capannone dal tumore primario intravasate vascolare sangue e del sistema linfatico, in tal modo, l'accesso a estravasare e formare una nicchia secondaria. Il stravaso delle cellule tumorali dal sistema vascolare sanguigno può essere studiata utilizzando cellule endoteliali (EC) e cellule tumorali ottenute da linee cellulari differenti. Gli studi iniziali sono stati condotti utilizzando condizioni statiche, ma si è ben documentato che i CE si comportano in modo diverso in condizioni di flusso fisiologiche. Pertanto, diversi gruppi da camera di flusso sono attualmente utilizzate per studiare le interazioni delle cellule cancro con EC. Assemblee camera di flusso attuali offrono risultati riproducibili utilizzando sia linee cellulari diversi o fluido a differenti condizioni di stress di taglio. Tuttavia, per osservare e studiare le interazioni con cellule rare come cellule tumorali circolanti (CTC), sono necessarie alcune modifiche da apportare al gruppo di camera di flusso convenzionale. CTCsono una popolazione di cellule rare tra milioni di cellule del sangue. Di conseguenza, è difficile ottenere una popolazione pura di CTC. Contaminazione delle CTC con diversi tipi di cellule che normalmente si trovano in circolazione è inevitabile utilizzare presente arricchimento o tecniche di esaurimento. Nel presente rapporto, descriviamo un metodo unico per etichette circolanti cellule tumorali della prostata modo fluorescente e studiare le loro interazioni con EC in un sistema di camera di flusso auto-assemblati. Questa tecnica può essere ulteriormente applicato ad osservare le interazioni tra CTC prostata e qualsiasi proteina di interesse.
Introduction
Metastasi è un complesso processo multi-step che rimane poco conosciuta. L'asse ligando E-selectin/selectin ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella metastasi del tumore promuovendo interazioni adesive principali tra l'endotelio vascolare e cellule tumorali 1,2. Endoteliale (E)-selectina è una proteina transmembrana espressa dalle cellule endoteliali attivate, mentre differente ligando E-selectina (s) sono espressi dalle cellule tumorali 3. Numerosi approcci in vitro sono stati impiegati con successo per modellare interazioni ligando E-selectin/selectin tra cellule tumorali e cellule endoteliali (EC) 1. Per studiare queste interazioni, diversi sistemi di camera di flusso vengono impiegati per simulare sistema vascolare sanguigno. Tra assembly camera di flusso, a piatti paralleli camera di flusso (PPFC) in combinazione con EC è abitualmente utilizzato come modello in vitro simulando in condizioni di stress taglio vivo. In questometodo, EC sono coltivate su un piatto da 35 mm e dopo aver ottenuto un monostrato, EC sono attaccati alla PPFC e gli esperimenti shear stress sulla base vengono eseguite.
Tuttavia, PPFC e altri sistemi attuali presentano molte limitazioni per studiare le interazioni adesive tra cellule tumorali circolanti (CTC) derivate da pazienti e EC, in primo luogo, perché CTC sono una rara popolazione di cellule, versato dal tumore primario, che circola tra milioni di cellule del sangue (1 CTC per 10 9 cellule ematiche) 4. Quindi, a differenza di fornitura illimitata di linee cellulari in coltura, bassa conta CTC portare ad interazioni molto poche e rare CTC / CE, che richiede un'adeguata larghezza di canale di flusso per registrare le interazioni per l'analisi di riproduzione. Inoltre, dal momento che pazienti CTC derivati sono una popolazione impura, quindi un marcatore di identificazione è necessaria per tenere traccia CTC in specifico. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per identificare il cancro alla prostata (PCA) CTCs approfittando del fatto che la quasi totalità di questi CTC esprimono prostatico specifico antigene di membrana (PSMA) sulla loro superficie cellulare 5,6. In questa relazione, abbiamo utilizzato la linea di cellule di cancro alla prostata, MDA PCa2b (MDA), per dimostrare la potenziale utilità del nostro nuovo sistema per lo studio della prostata interazioni CTC con EC, alla fine di capire il meccanismo di metastasi.
La nostra metodologia può essere applicata per vari esperimenti di taglio basato simulano nel sistema di vivo vascolare 7-9. Oltre ad esaminare le interazioni PCa CTC / CE, l'attuale sistema di camera di flusso potrebbe essere facilmente adattato per l'analisi di cellule mononucleari del sangue periferico o interazioni cellule tumorali "con EC. La facilità di smontaggio e rimontaggio della camera di flusso, un MicroSlide III (0,1) (in appresso MicroSlide), permette la coltura EC sotto perfusione e stimolante EC con differenti citochine di indurre protein espressione. Inoltre, colta EC, proteine ricombinanti come la P-selectina-E e possono essere rivestiti sul MicroSlide e le interazioni con le cellule tumorali possano essere rispettati in condizioni di flusso laminare 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa del basso numero di CTC tra cellule del sangue, è difficile isolare CTC come una popolazione pura di cellule. Al fine di studiare le interazioni CTC / CE, la popolazione rara e impura delle CTC pone due sfide importanti: a) identificazione di CTC tra le cellule del sangue; b) Osservazione delle interazioni CTC / CE.
Per superare la prima limitazione di identificare CTC prostata tra le cellule del sangue, abbiamo approfittato del fatto che praticamente tut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del Dipartimento della Difesa prostatico Programma di Ricerca sul Cancro (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 dal National Cancer Institute, e il Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Vorremmo ringraziare il Dott. Annarita Lorenzo (Dipartimento di Patologia) per fornire gli anticorpi VE-caderina, e il dottor Marco Seandel (Dipartimento di Chirurgia) per la fornitura di HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
