환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에
Summary
우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다.
Abstract
전이는 종양 세포가 차 틈새 시장을 extravasate 및 양식에 대한 액세스를 확보함으로써, 기본 종양 intravasate 혈액 혈관과 림프 시스템에서 창고하는 과정이다. 혈액 혈관 시스템에서 종양 세포의 혈관 외 유출은 다양한 세포주에서 얻은 내피 세포 (EC에) 및 종양 세포를 이용하여 연구 될 수있다. 초기 연구는 정적 조건을 사용하여 실시되었다하지만 그것은 잘되는 EC 생리 흐름 조건에서 다르게 행동하는 것이 설명되어 있습니다. 따라서, 다른 유동 챔버 조립체는 현재의 EC와 암세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용되고있다. 현재 유량 용기 어셈블리는 다른 전단 응력 조건에서 서로 다른 세포주 또는 유체를 사용하여 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나, 관찰하고 종양 세포 (의 CTCs)를 순환하는 희귀 세포와의 상호 작용을 연구하기 위해, 특정 변경 내용은 기존의 유량 용기의 조립을 할 필요합니다. 의 CTCs혈액 세포의 수백만 사이 희소 세포 집단이다. 결과적으로,의 CTCs 순수 인구를 얻기 어렵다. 정상적으로 순환에서 발견 세포의 다른 유형의 CTCs 오염은 본 농축 또는 공핍 기술을 사용 불가피하다. 본 보고서에서, 우리는 형광 라벨 순환하는 전립선 암 세포에 고유 한 방법을 설명하고 자기 조립 흐름 챔버 시스템에서의 EC와의 상호 작용을 연구한다. 이 기술은 또한 전립선의 CTCs 및 또한 어떤 단백질 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
전이가 제대로 이해 남아있는 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. E-selectin/selectin 리간드 축은 혈관 내피 세포와 암세포 간의 1,2 차 접착제 상호 작용을 촉진함으로써 종양 전이에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 다른 E-셀렉틴 리간드 (들) 종양 세포 (3)에 의해 표현되는 반면 내피 (E)-셀렉틴은 활성화 된 내피 세포에 의해 발현 막 횡단 단백질이다. 다수의 체외 방법이 성공적으로 종양 세포와 내피 세포 사이의 E-selectin/selectin 리간드 상호 작용되는 EC (1) 모델로 사용되어왔다. 이러한 상호 작용을 연구하기 위해, 다른 흐름 챔버 시스템은 혈액 혈관 시스템을 시뮬레이션하기 위해 사용하고있다. 유량 용기 어셈블리 중, 내피와 함께 병렬 플레이트 흐름 챔버 (PPFC)는 정기적으로 생체 전단 응력 조건에서 시뮬레이션 체외 모델로 사용됩니다. 이에방법, 내피는 35 mm 접시에 성장하고 단일 층을 달성 한 후, 내피는 PPFC에 부착하고 전단 응력을 기준으로 실험이 수행된다.
그러나 PPFC과 다른 현재의 시스템은 환자와 내피에서 파생 된 종양 세포 (의 CTCs)를 순환 사이의 접착제의 상호 작용을 연구하는 많은 제약을 제시 주로의 CTCs는 혈액 세포의 수백만의 사이에 순환, 기본 종양에서 흘려 세포의 희소 한 인구 때문에 (1 CTC 9 혈구 열마다) 4. 따라서, 배양 세포 라인의 무제한 공급과 달리 낮은 CTC 수는 재생 분석을위한 상호 작용을 기록하는 적절한 흐름의 채널 폭을 필요로하는, 매우 적은 희귀 CTC / EC의 상호 작용을지도한다. 환자 유래의 CTCs가 불순한 인구 때문에 또한, 따라서 식별 마커는 특정의 CTCs를 추적해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 (PCA) CT 전립선 암을 확인하는 새로운 방법을 개발CS 거의 모든 이들의 CTCs가 자신의 세포 표면 5,6에 전립선 특이 막 항원 (PSMA)을 표현한다는 사실을 활용하여. 이 보고서에서, 우리는 결국 전이의 메커니즘을 이해하기 위해, 내피로 전립선 CTC 상호 작용을 연구하기위한 새로운 시스템의 잠재적 인 유틸리티를 보여, 전립선 암 세포주 MDA PCa2b (MDA)를 사용했다.
우리의 방법은 생체 내 혈관 시스템 7-9에서 시뮬레이션 각종 전단을 기준으로 실험에 적용 할 수 있습니다. PCA CTC / EC 상호 작용을 조사 외에, 전류 흐름 챔버 시스템은 쉽게 말초 혈액 단핵 세포를 분석하거나 내피와 종양 세포의 상호 작용을 위해 구성 될 수있다. 분해 및 유량 용기의 재 조립의 용이성,하는 마이크로는 III (0.1) (이하 마이크로 슬라이드로 함), 관류 및 홍보를 유도하는 다른 사이토 카인과 내피를 자극에서 배양되는 EC 수 있습니다식을 otein. 또한, 배양 된 내피 같은 E-셀렉틴 및 P-재조합 단백질은 종양 세포와 상호 작용하는 마이크로 슬라이드 상에 코팅 할 수는 층류 조건 (10)으로 관찰 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인해 혈액 세포들 사이의 CTCs 낮은 숫자로, 그것은 세포의 순수로의 CTCs 모집단을 분리하는 것이 곤란하다. CTC / EC의 상호 작용을 연구하기 위해,의 CTCs 희귀하고 불순한 인구는 두 가지 주요 도전 포즈 : 혈액 세포들 사이의 CTCs) 확인을; B) CTC / EC의 상호 작용을 관찰.
혈액 세포들 전립선의 CTCs 식별 첫번째 한계를 극복하기 위해, 우리는 사실상 모든 전립?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부서의 방어 전립선 암 연구 프로그램 (W81XWH-12-1-0124)에서 자금에 의해 지원되었다, 국립 암 연구소, 그리고 로버트 McCooey 비뇨 생식기 종양학 연구 기금 U54CA143876. 우리는 HUVEC를 제공을위한 VE-cadherin의 항체를 제공하기 위해 박사 Annarita 로렌조 (병리학 교실)를 감사, 박사 마르코 Seandel (외과학 교실) 것이다.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
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