Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em> Ex vivo</em> fibroblastes
Summary
Profilage moléculaire des cellules laser microdissection et le stroma des modèles synthétiques, de l'ingénierie tissulaire du cancer colorectal représente une approche nouvelle et manipulable à caractériser et à disséquer la biologie particulière à l'interface entre les cellules tumorales à la cellules stromales associées au cancer invasif et avant.
Abstract
Envahir le cancer colorectal (CRC), les cellules ont acquis la capacité de se libérer de leurs cellules sœurs, s'infiltrer dans le stroma, et remodeler la matrice extracellulaire (MEC). La caractérisation de la biologie de ce groupe phénotypique distincte de cellules pourrait améliorer considérablement notre compréhension des événements précoces lors de la cascade métastatique.
invasion tumorale est un processus dynamique facilitée par des interactions bidirectionnelles entre épithélium malin et le stroma de cancer associé. Afin d'examiner les réponses spécifiques des cellules au stroma tumoral interface, nous avons combiné organotypique co-culture et des techniques de micro-dissection laser.
Modèles organotypiques, dans lesquels les mandants stromales clés telles que les fibroblastes sont 3 dimentioanally co-cultivées avec des cellules épithéliales cancéreuses, sont des outils expérimentaux très manipulables qui permettent invasion et interactions stroma-cancer à étudier dans un proche-phconditions ysiological.
Microdissection laser (LMD) est une technique qui implique la dissection chirurgicale et l'extraction des différentes couches au sein du tissu tumoral, avec une précision de l'ordre du micron.
En combinant ces techniques avec le profilage génomique, transcriptomique et épigénétique nous visons à développer une compréhension plus profonde des caractéristiques moléculaires des cellules tumorales envahissantes et tissu stromal environnante, et en faisant éventuellement révéler de nouveaux biomarqueurs et des opportunités pour le développement de médicaments dans CRC.
Introduction
Co-cultures organotypiques sont des modèles à partir de tissus qui aide à la reconstruction de la micro-vivo dans la tumeur en trois dimensions en juxtaposant les cellules épithéliales malignes et les cellules stromales dans un gel de collagène contenant des composants de la matrice extracellulaire essentiels 3.1. Principalement conçu comme une méthode de mesure de l'invasion tumorale, organotypics réduire la dépendance in vivo dans des modèles animaux, et d'éviter les défauts des autres techniques in vitro tels que des dosages Transwell, dans lequel les cellules sont forcées artificiellement d'invasion dans un état monodispersé 2-4. L'inclusion de cellules stromales dans ces modèles, telles que les fibroblastes, reflète le rôle fondamental du micro-environnement de la tumeur maligne dans la régulation de l'invasion et la métastase 4.3, cependant l'hétérogénéité phénotypique du stroma est telle que, pour optimiser la pertinence physiologique de organotypique modèles, pour certains organes, anatomiquement exactes ex vivofibroblastes doivent être inclus autant que possible de 3,6.
Organotypics sont une plate-forme polyvalente pour étudier les interactions entre la tumeur et les cellules stromales et sont de plus en plus utilisés dans de nouvelles façons d'examiner l'impact sur l'invasion tumorale des inhibiteurs chimiques et des altérations de gènes ciblés 7,8. L'étude de la marge de la tumeur invasive est une perspective particulièrement intéressante. Dans les modèles organotypiques, le cancer colorectal mis en place (CRC) des lignées cellulaires produisent typiquement une couche épithéliale bien stratifié, et en coupe, les cellules qui ont acquis la capacité d'envahir la matrice extracellulaire (MEC) sont facilement repérables. Compte tenu de l'hétérogénéité des micro-topographique établi de tumeur et associés à une tumeur des cellules stromales in vivo, l'extraction de ces cellules à l'aide de laser microdissection et de les étudier dans l'isolement, peut révéler des indications biologiques importantes concernant l'origine des métastases du cancer colorectal et la façon dont il peut être plus efficace, ciblée. Jen la méthodologie suivante, tous les patients qui ont donné des échantillons de tissus fournis le consentement éclairé, et l'étude a été approuvée par les institutions du comité d'éthique de la recherche au niveau régional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un procédé pour isoler et caractériser spécifiquement les cellules tumorales qui ont acquis la capacité d'envahir le stroma associé au cancer au cours des premiers stades de la progression métastatique dans un produit d'assemblage en 3 dimensions de co-culture de cellules épithéliales et stromales.
Modèles de co-culture comprenant des cellules épithéliales CRC juxtaposés avec un stroma synthétique contenant ex vivo des fibroblastes du côlon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MB est soutenu par des subventions d'une bourse de la MRC. KP et AHM sont pris en charge par des subventions de recherche médicale Wessex et Cancer Research UK / RCS (Angleterre) (C28503/A10013). Nous sommes reconnaissants pour le soutien de l'Université de Southampton Unité de recherche histochimie.
Materials
| Colorectal cancer cell lines – example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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