Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и<em> Экс естественных</em> Фибробласты
Summary
Молекулярная профилирования лазерных микродиссекции клеток и стромы из синтетических, тканевой инженерии моделей колоректального рака представляет собой новый и которыми можно манипулировать подход характеризовать и анализировать отличительные биологии на границе раздела между опухолевых клеток в передней и инвазивного рака связаны стромальных клеток.
Abstract
Вторжение колоректального рака (CRC) клетки приобрели способность освободиться от своих сестринских клеток, проникнуть стромы и реконструировать внеклеточный матрикс (ECM). Характеризуя биологии этого фенотипически отдельной группы клеток могут существенно улучшить наше понимание ранних событий в течение метастатического каскада.
Опухоль вторжение представляет собой динамический процесс облегчается двунаправленного взаимодействия между злокачественной эпителия и рака связаны стромы. С целью изучения клеточно-специфической реакции в строме опухолевой-интерфейса мы сочетании Органотипической совместное культивирование и лазерные методы микро-рассечение.
Органотипической модели, в которых ключевые стромальных составляющие, такие как фибробласты 3-dimentioanally совместном культивировании с раковыми эпителиальных клеток, весьма, которыми можно манипулировать экспериментальные инструменты, которые позволяют вторжение и рак-стромы взаимодействия, чтобы быть изучены в ближайшем телysiological условия.
Лазерная микродиссекции (РМР) представляет собой метод, который влечет за собой хирургическое вскрытие и извлечение различных слоев в опухолевой ткани, с точностью уровня микрон.
Комбинируя эти методы с геномной, транскриптомных и эпигенетической профилирования мы стремимся развивать более глубокое понимание молекулярных характеристик вторжения опухолевые клетки и окружающие стромальную ткань, и при этом потенциально выявить новые биомаркеры и возможности для разработки лекарств в КПР.
Introduction
Органотипической со-культуры являются тканевой инженерии модели, которые помогают в восстановлении в естественных условиях опухоли микроокружения в 3 измерениях путем сопоставления злокачественные эпителиальные клетки и стромальные клетки в коллагенового геля, содержащей существенные компоненты внеклеточного матрикса 1-3. В принципе задумана как метод измерения опухолевой инвазии, organotypics уменьшить зависимость от ин виво животных моделях, и избежать недостатков других методов в пробирке, таких как Transwell анализов, в которых вторжение клетки вынуждены искусственно в монодисперсные состоянии 2-4. Включение стромальных клеток в этих моделях, таких как фибробласты, отражает важную роль микросреды опухоли в регулировании злокачественной инвазии и метастазирования 3-4, однако фенотипическая гетерогенность стромы такова, что в целях обеспечения максимальной физиологическое значение Органотипической модели, определенный орган, анатомически точны экс естественныхфибробласты должны быть включены по мере возможности 3,6.
Organotypics являются универсальной платформой для изучения взаимодействия между опухолью и стромальных клеток и все чаще используются в новых способов для изучения влияния на опухолевой инвазии химических ингибиторов и целевых изменения гена 7,8. Изучая инвазивной запас опухоли является особенно захватывающая перспектива. В органотипических моделей, созданная колоректальный рак (CRC) клеточные линии, как правило, производят также стратифицированную эпителиального слоя, и в поперечном сечении, клетки, которые приобрели способность вторгаться внеклеточный матрикс (ECM) легко различимы. В свете сложившейся микро-топографической неоднородностью опухоли и опухоли связано стромальных клеток в естественных условиях, извлечение этих клеток с помощью лазерного микродиссекции и изучение их в изоляции, может выявить важные биологические идеи относительно истоков колоректального метастазов рака и как это может быть более эффективно целенаправленными. Ян следующая методология, все пациенты, которые пожертвовали образцы ткани было получено письменное информированное согласие, а исследование было одобрено учреждений региональных исследовательских комитет по этике.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем метод специально выделить и охарактеризовать опухолевые клетки, которые приобрели способность вторгаться в рака, связанного стромы на самых ранних стадиях метастатического прогрессирования в 3-мерном сокультуры конструкции эпителиальных и стромальных клеток.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
МБ поддерживается грантового финансирования из общения MRC. КП и АНМ поддерживаются грантового финансирования из Уэссекса медицинских исследований и исследований рака Великобритании / RCS (Англия) (C28503/A10013). Мы благодарны за поддержку университета Саутгемптона гистохимия исследовательское подразделение.
Materials
| Colorectal cancer cell lines – example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
