Molekylär profilering av Invasive tumormicroenvironmenten i en 3-dimensionell modell av kolorektal cancer celler och<em> Ex vivo</em> Fibroblaster
Summary
Molekylär profilering av laser microdissected celler och stroma från syntetiska, vävnadstekniska kolorektalcancer modeller representerar en roman och manipulerbar metod för att karakterisera och dissekera den distinkta biologin i gränssnittet mellan tumörceller vid den invasiva fronten och cancer tillhörande stromaceller.
Abstract
Invaderande kolorektal cancer (CRC) celler har förvärvat förmågan att bryta sig loss från sina systerceller, infiltrera stroma, och omforma den extracellulära matrisen (ECM). Karakterisera biologin av denna fenotypiskt distinkt grupp av celler skulle väsentligt förbättra vår förståelse av tidiga händelser under metastaserande kaskad.
Tumör invasion är en dynamisk process underlättas av dubbelriktade samspelet mellan malignt epitel och cancer associerade stroma. För att undersöka cellspecifika svar på tumör stroma-gränssnittet har vi kombinerat organotypisk co-kultur-och lasermikro dissektion tekniker.
Organotypiska modeller, där viktiga stromal beståndsdelar såsom fibroblaster är 3-dimentioanally co-odlade med cancer epitelceller, är mycket manipulerbar experimentella verktyg som möjliggör invasion och cancer-stroma interaktioner som skall studeras i nära-physiological förhållanden.
Laser microdissection (LMD) är en teknik som innebär att kirurgisk dissektion och utvinning av de olika skikten i tumörvävnad, med micron nivå precision.
Genom att kombinera dessa tekniker med genomisk, transcriptomic och epigenetisk profilering strävar vi efter att utveckla en djupare förståelse för de molekylära egenskaper invaderande tumörceller och omgivande stromal vävnad, och därmed potentiellt avslöja nya biomarkörer och möjligheter för utveckling av läkemedel i barnkonventionen.
Introduction
Organotypiska samkulturer är vävnadstekniska modeller som stöd i att rekonstruera in vivo tumormicroenvironmenten i 3-dimensioner genom juxtaposing maligna epitelceller och stromaceller i en kollagen gel som innehåller väsentliga extracellulära matrixkomponenter 1-3. Huvudsakligen tänkt som en metod för att mäta tumörinvasion, organotypics minska beroendet av in vivo-djurmodeller, och undviker de brister hos andra tekniker in vitro, såsom Transwell-analyser, i vilka invaderande celler tvingas artificiellt i en mono-dispergerat tillstånd 2-4. Införandet av stromaceller i dessa modeller, såsom fibroblaster, återspeglar den viktiga roll tumormicroenvironmenten i regleringen av malign invasion och metastasering 3-4, men den fenotypiska heterogenitet stroma är sådan att för att maximera den fysiologiska relevansen av organotypisk modeller, organspecifika, anatomiskt korrekta ex vivofibroblaster bör inkluderas där så är möjligt 3,6.
Organotypics är en mångsidig plattform för att studera interaktioner mellan tumör-och stromaceller och används alltmer på nya sätt för att undersöka påverkan på tumörinvasion av kemiska hämmare och riktade gen 7,8 förändringar. Studera den invasiva tumörmarginalen är en särskilt spännande utsikter. I organotypic modeller etablerade kolorektal cancer (CRC)-cellinjer producerar typiskt en väl stratifierat epitel-skikt, och i tvärsnitt, celler som har förvärvat förmågan att invadera den extracellulära matrisen (ECM) är lätt att urskilja. Mot bakgrund av den etablerade mikro topografisk heterogenitet tumörer och tumörassocierade stromaceller in vivo, utvinna dessa celler med hjälp av laser microdissection och studera dem i isolering, kan avslöja viktiga biologiska insikter om ursprunget till kolorektal cancer metastaser och hur det kan vara mer effektivt målinriktad. Jagn följande metod, alla patienter som donerat vävnadsprover som skriftligt informerat samtycke, och studien godkändes av institutionerna regionala forskningsetisk kommitté.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method to specifically isolate and characterize tumor cells which have acquired the capacity to invade the cancer associated stroma during the earliest stages of metastatic progression in a 3-dimensional co-culture construct of epithelial and stromal cells.
Co-culture models comprised of CRC epithelial cells juxtaposed with a synthetic stroma containing ex vivo human colonic fibroblasts were used to study CRC invasion in 3-dimensions. This physiologically relev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MB is supported by grant funding from an MRC fellowship. KP and AHM are supported by grant funding from Wessex Medical Research and Cancer Research UK/RCS (England) (C28503/A10013). We are thankful for the support of the University of Southampton Histochemistry Research Unit.
Materials
| Colorectal cancer cell lines – example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
