Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía
Summary
Modelos de progresión de la enfermedad espontánea carcinoma metastásico de células renales (CCR) pueden ser utilizados para la evaluación de los tratamientos en un entorno clínicamente relevante. Este protocolo demuestra diferentes procedimientos para la implantación de células tumorales de riñón ortotópico, nefrectomía adecuado, y finalmente describe una guía para la necropsia de puntuación visual y bioluminiscente de carga metastásica y la localización.
Abstract
Uno de los retos clave para la mejora de las pruebas de nuevas terapias experimentales en el carcinoma de células renales (CCR) es el desarrollo de modelos que fielmente recapitula progresión de la enfermedad metastásica temprana y tardía etapa. Modelos típicos implantación del tumor utilizan la implantación del tumor primario ectópico o ortotópico, pero pocos incluyen la enfermedad metastásica espontánea sistémica que imita el entorno clínico. Este protocolo describe los pasos clave para el desarrollo de la progresión de la enfermedad RCC en escena similar a los pacientes. En primer lugar, se utiliza un ratón línea celular de tumor altamente metastásica en un modelo singénico para mostrar la implantación de células del tumor ortotópico. Los métodos incluyen la implantación superficial e interna en el espacio subcapsular con células combinadas con Matrigel para evitar fugas y la propagación temprana. Siguiente que describe los procedimientos para la escisión de portador de un tumor de riñón (nefrectomía), con cuidado de ratón pre-y post-quirúrgico crítico. Por último, se describen los pasos necesarios para controlar y evaluarmicro y macro-evolución de la enfermedad metastásica, incluyendo imágenes bioluminiscentes, así proporciona una guía visual necropsia detallada para anotar distribución de la enfermedad sistémica. El objetivo de esta descripción del protocolo es facilitar el uso generalizado de los modelos CCR metastásico clínicamente relevantes para mejorar el valor predictivo de la futura prueba terapéutica.
Introduction
La causa principal de mortalidad en pacientes con carcinoma de células renales (RCC) es la enfermedad metastásica sistémica que se produce normalmente después de la extracción quirúrgica de un tumor primario de crecimiento en el riñón. Sin embargo, muy pocos modelos tumorales preclínicos que evaluaron terapéutica experimental en ratones incluyen la enfermedad metastásica, y menos aún recapitulan fielmente las etapas clínicas de crecimiento localizado, la cirugía, y el inicio de micro-metástasis espontánea y progresión 1-3. Esta brecha en la prueba se ha convertido cada vez más importante en la evaluación de nuevas terapias como a veces sorprendentes efectos antitumorales observados en modelos animales no siempre se tradujo en un éxito similar tratamiento de los pacientes 4. Estas diferencias en los resultados pueden deberse a eficacias de drogas diferenciales entre modelos de tumores localizados ectópicos o ortotópico primarios y la fase tardía de la enfermedad metastásica 5-7. En el caso de RCC, sólo unos pocos estudios han empleado establecieron unNimal protocolos que incluyen la enfermedad recurrente espontánea que imita los pacientes que típicamente han tenido riñones con tumores en su totalidad o parcialmente removidos 2,3. Las razones de esta escasez de pruebas de modelo de ratón varían. En primer lugar, es el alto costo de los animales y la variabilidad inherente de la selección de las células tumorales y el potencial metastásico. Por ejemplo, las líneas celulares de riñón humano tienden a hacer metástasis raramente, y deben ser seleccionados a través de múltiples rondas de implantación primaria ortotópico metastásico y selección para derivar las variantes que difunden de manera consistente y forman lesiones a distancia (véase la descripción de una línea celular tal derivación humana 8-10) . Por el contrario, las células de ratón en modelos inmunocompetentes tienden a comportarse de manera agresiva, y los números bajos de células deben ser inyectados con matrigel para reducir la diseminación sistémica inmediata 3. En segundo lugar, las dificultades técnicas para la realización de la implantación adecuada, la resección quirúrgica (nefrectomía), y el seguimiento (y cuantificar) metastati espontáneac del crecimiento puede ser un reto y varias variables críticas que plantearse cuando se emplea esta técnica (véase la discusión para más detalles). El objetivo de este protocolo es describir los pasos esenciales (así como los peligros potenciales) de la implantación ortotópica, la resección (nefrectomía), y el seguimiento de la enfermedad CCR metastásico espontánea y ofrecer una guía para estandarizada (y más extendido) utilizar los laboratorios científicos que evalúan la eficacia de la terapéutica experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
El propósito de este protocolo es para evaluar la enfermedad metastásica espontánea clínicamente relevante utilizando un modelo de ratón del tumor singénico para describir las técnicas de implantación / resección. Actualmente, la mayoría de los estudios preclínicos evaluación de nuevas terapias experimentales no incluyen el estudio de la enfermedad metastásica y sólo unos pocos recapitular las etapas de crecimiento del tumor primario, la resección quirúrgica, y la eventual diseminación metastásica espo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos con el laboratorio del Dr. Robert S. Kerbel (Universidad de Toronto, el Instituto de Investigación Sunnybrook, Toronto, Canadá) para la ayuda técnica y la experiencia en el desarrollo de este procedimiento. También nos gustaría dar las gracias a la Dra. Sandra Sexton y el Roswell Park Departamento de Recursos Animales de Laboratorio del Instituto del Cáncer. Este trabajo fue apoyado por un premio de la Fundación Alianza Roswell Park (a JMLE).
Materials
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt – 25mm blades – 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12cm lone | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01mg/mL | |||
| 25G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1mL syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
