Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
Le sous-cutanée de matrigel bouchon dosage chez la souris est une méthode de choix pour l'évaluation in vivo de facteurs pro et anti-angiogéniques. Dans ce procédé, les facteurs désirés sont introduits dans le gel de ECM-mimétique à froid liquide qui, après l'injection sous-cutanée, se solidifie pour former un milieu simulant le milieu du cancer. Cette matrice permet la pénétration des cellules hôtes telles que des cellules endotheliales, et donc, la formation de vaisseaux sanguins.
Ici, nous proposons une nouvelle analyse de bouchon de Matrigel modifié, qui peut être exploitée pour illustrer le potentiel angiogénique d'une piscine de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses, par opposition à un élément spécifique (par exemple, le bFGF et le VEGF) ou un agent. La fiche contenant du gel de ECM-synoptique est utilisée pour introduire l'hôte (ce est à dire, souris) avec un pool de facteurs sécrétés au CM de cellules de glioblastome tumorales génératrices à croissance rapide. Nous avons déjà décrit une comparaison approfondie du potentiel angiogénique deU-87 MG glioblastome humain clone et de son dérivé dormant, dans ce modèle de système, montrant l'angiogenèse induite dans les cellules parentales MG U-87. Le CM est préparé en filtrant les médias recueillies à partir de plaques de culture de tissus de confluence des deux lignée cellulaire suivants 48 heures d'incubation. Par conséquent, il ne contient que des facteurs sécrétés par les cellules, sans que les cellules elles-mêmes. On décrit ici est la combinaison de deux techniques d'imagerie, micro-bulles imagerie ultrasonore à contraste amélioré et intravitale endomicroscopie de fibrée-confocale, pour une précision, la caractérisation en temps réel de la mesure, de la morphologie et de la fonctionnalité de nouvellement formés vaisseaux sanguins dans les bouchons.
Introduction
L'essai d'angiogenèse de bouchon de Matrigel a été décrit en premier par Kibbey et al. En 1992, où elle a été utilisée pour évaluer la stimulation de l'angiogenèse par la SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) une. Contrairement à d'autres essais in vivo de l'angiogenèse, comme l'angiogenèse de la cornée de souris ou de poulet dosages de membrane chorio, ce dosage est relativement facile à réaliser deux. Le gel d'ECM-mimétique injecté peut contenir des cellules pro-angiogénique, ou un des composés anti-angiogènes et / ou facteurs. Lors de l'évaluation de l'activité d'un composé anti-angiogénique, le bouchon contient normalement un mélange de facteur de croissance endothelial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), et la substance anti-angiogénique peut être administré directement dans le bouchon ou systémique 3, 4.
Le gel de ECM-synoptique est injection sous-cutanée où il se solidifie en quelques minutes. Évaluation de recrutement des vaisseaux sanguins dans le bouchon résultant est typically effectuée en mesurant le taux d'hémoglobine à l'intérieur de la prise, par mesure du signal de fluorescence suite à l'injection de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au dextran, par immunocoloration de coupes histologiques de marqueurs spécifiques endothéliales ou de cellules activé par fluorescence (FACS) 2,5, 6. Cependant, cette évaluation ne permet qu'une analyse de point final et n'a pas d'informations sur la fonctionnalité et la morphologie des vaisseaux sanguins. En outre, les mesures de volume de plasma, soit par le taux d'hémoglobine ou de dextran-FITC en utilisant comme indicateur, peut être trompeuse, car la teneur en sang est affectée par la taille des vaisseaux sanguins et l'étendue de mares de sang. Cela est particulièrement important lorsque le système vasculaire recruté est caractérisée par la perméabilité accrue et la rétention (EPR) effet 7.
Nous vous proposons ici un nouveau plus précise, un procédé pour la visualisation des vaisseaux sanguins recrutés, en combinant les deux techniques d'imagerie complémentaires. Higmicrobulles h résolution ultrasons contraste amélioré (US) combinés avec intravitale fibré-confocale endomicroscopie peut fournir des informations non seulement sur la densité des vaisseaux sanguins, mais aussi sur leur morphologie et leur fonctionnalité. En outre, cette analyse peut être effectuée à plusieurs points dans le temps permettant ainsi le suivi de la cinétique de l'angiogenèse. États-Unis sont une modalité d'imagerie largement utilisé qui possède une haute résolution spatiale pour les vaisseaux sanguins imagerie suivante par voie intraveineuse (iv) injection de microbulles qui restent exclusivement dans le compartiment vasculaire 8-11. Les microbulles sont microbulles remplies de gaz qui produisent un signal échogène forte lorsqu'il est excité avec une impulsion des États-Unis et servir ainsi comme un bon agent de contraste. Des images 3D de la fiche sont acquises à l'aide du logiciel de système d'imagerie Etats-Unis après la destruction des microbulles. Les images obtenues sont composées de trames d'image avant et après la destruction de microbulles et reflètent la différence d'intensité de la vidéo en couleur. Ces superposéeles images sont affichées automatiquement par le logiciel. Par conséquent, le pour cent de vaisseaux fonctionnels dans le bouchon peut être quantifiée. Haute résolution fibrée endomicroscopie confocale sert de modalité d'imagerie complémentaire en signalant sur les vaisseaux sanguins morphologie. Dans cette méthode minimalement invasive, les images sont acquises suite à l'administration intraveineuse de dextran conjugué au FITC 12. Le polymère fluorescent teint dans la circulation sanguine et sert comme un «agent de contraste» pour les vaisseaux sanguins morphologie et la circulation sanguine ainsi. En outre, étant donné que le polymère est injecté à une taille de 70 kDa, il ne peut traverser les vaisseaux qui fuient que l'on trouve dans le système vasculaire tumoral. Cela se traduira par du bruit de fond élevé de dextrane marqué au FITC à l'extérieur des vaisseaux sanguins. Par conséquent, endomicroscopie confocale fibrée peut être utilisé pour visualiser les caractéristiques typiques de l'effet EPR dans la tumeur qui fuient agrandies navires, neovasculature-, hautement enchevêtrées, avec des extrémités franches.
Ce modèle de système a été décrilit dans la comparaison du potentiel angiogénique de U-87 MG glioblastome humain clone et son dormant 13. La vascularisation dans les bouchons a été évalué trois semaines après l'inoculation de gel ECM-synoptique. Il a été montré que la vascularisation à l'intérieur des bouchons contenant CM U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices a été augmenté de façon significative en termes de nombre, la densité et la fonctionnalité, par rapport à la vascularisation à l'intérieur des bouchons contenant CM de cellules tumorales génératrices de dormance. Par conséquent, les auteurs ont pu conclure que CM isolé du U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices contient des niveaux plus élevés de facteurs pro-angiogéniques, par rapport à la CM de cellules tumorales génératrices dormants. Ces facteurs stimulent la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels par un effet positif sur toutes les étapes de la cascade angiogénique (par exemple, la prolifération, la germination, la migration et finalement, la formation de structures tubulaires de cellules endothéliales).
Protocol
Representative Results
Discussion
Combinant les méthodes d'imagerie complémentaires permet l'acquisition d'informations sur la densité des microvaisseaux, la fonctionnalité et la morphologie de différentes composantes de l'angiogenèse. Chargement CM sur les bouchons de gel ECM-synoptique génère un microenvironnement tumoral, qui est séparée des autres populations de cellules, comme les cellules endotheliales, qui sont recrutés et se extravaser dans le bouchon.
En effectuant, en parallèle, des micr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
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