Monitoreo Funcionalidad y Morfología de Vasculatura Reclutado por factores secretados por las células tumorales generadoras de crecimiento rápido
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
El ensayo de tapón de matrigel subcutánea en ratones es un método de elección para la evaluación in vivo de los factores pro- y anti-angiogénicos. En este método, los factores deseados se introducen en gel-ECM sinóptico frío líquido que, después de la inyección subcutánea, se solidifica para formar un entorno que imita el entorno cáncer. Esta matriz permite la penetración de las células huésped, tales como células endoteliales, y por lo tanto, la formación de la vasculatura.
En este documento se propone un nuevo ensayo de tapón de matrigel modificado, que puede ser explotada para ilustrar el potencial angiogénico de un grupo de factores secretados por las células de cáncer, a diferencia de un factor específico (por ejemplo, bFGF y VEGF) o agente. El tapón que contiene gel ECM imitador se utiliza para introducir el anfitrión (es decir, el ratón) con un grupo de factores secretados a la CM de células de glioblastoma tumorales generadoras de crecimiento rápido. Hemos descrito previamente una extensa comparación del potencial angiogénico deU-87 MG glioblastoma humano y su clon derivado latente, en este modelo de sistema, que muestra la angiogénesis inducida en las células U-87 MG parentales. El CM se prepara mediante el filtrado de los medios recogidos a partir de placas de cultivo confluente de cualquiera de las líneas de células después de la incubación de 48 horas. Por lo tanto, sólo contiene factores secretados por las células, sin las propias células. Describe aquí es la combinación de dos modalidades de imagen, las microburbujas de imágenes por ultrasonido de contraste mejorado y intravital endomicroscopía con fibras confocal, para una precisa, la caracterización en tiempo real de la medida, la morfología y la funcionalidad de los vasos sanguíneos recién formados dentro de los tapones.
Introduction
El ensayo de angiogénesis enchufe matrigel fue descrita por primera vez por Kibbey et al., En 1992, donde fue utilizado para evaluar la estimulación de la angiogénesis por el SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. En contraste con otros ensayos de angiogénesis in vivo, como el ratón angiogénesis corneal o ensayos de membrana corioalantoidea de pollo, este ensayo es relativamente fácil de realizar 2. El gel-ECM mímica inyectado puede contener células, pro-angiogénico o un compuestos y / o factores anti-angiogénicos. Al evaluar la actividad de un compuesto anti-angiogénico, el tapón normalmente contiene una mezcla de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y la sustancia anti-angiogénico se puede administrar directamente en el enchufe o sistémicamente 3, 4.
El gel-ECM sinóptico se inyecta por vía subcutánea donde se solidifica dentro de minutos. Evaluación de reclutamiento de vasos sanguíneos en el tapón resultante es typically realizado mediante la medición de los niveles de hemoglobina dentro del tapón, por medición de la señal de fluorescencia después de la inyección de isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con dextrano, por inmunotinción de secciones histológicas para marcadores endoteliales específica o por células activadas por fluorescencia (FACS) 2,5, 6. Sin embargo, esta evaluación sólo permite el análisis de punto final y carece de información acerca de la funcionalidad y la morfología de los vasos sanguíneos. Además, las mediciones de volumen de plasma, ya sea por niveles de hemoglobina o mediante el uso de dextrano-FITC como un indicador, puede ser engañosa ya que el contenido de la sangre se ve afectada por el tamaño de los vasos sanguíneos y el grado de charcos estancados de sangre. Esto es especialmente crucial cuando la vasculatura reclutado se caracteriza por la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto 7.
Nos proponemos en el presente documento un nuevo más precisa, el método para la visualización de los vasos sanguíneos reclutados por la combinación de dos modalidades de imágenes complementarias. High microburbujas resolución mejorada de ultrasonido-contraste (Estados Unidos) combinado con intravital fibred-confocal endomicroscopía puede proporcionar información no sólo acerca de la densidad de los vasos sanguíneos, sino también en su morfología y funcionalidad. Además, este análisis se puede realizar en varios puntos de tiempo permitiendo así el seguimiento de la cinética de la angiogénesis. Estados Unidos es una técnica de imagen utilizada ampliamente que posee una alta resolución espacial de los vasos sanguíneos de imagen siguiente intravenosa (iv) la inyección de microburbujas que permanecen exclusivamente en el compartimento vascular 8-11. Las microburbujas son microburbujas llenas de gas que producen una señal ecogénica fuerte cuando se excita con un pulso de Estados Unidos y por lo tanto servir como un buen agente de contraste. Imágenes 3D del tapón se adquieren mediante el software de sistema de imagen de Estados Unidos después de microburbujas destrucción. Las imágenes resultantes se componen de cuadros de imágenes de antes y después de la destrucción de microburbujas y reflejan la diferencia en la intensidad de vídeo en color. Estos superpuestolas imágenes se muestran de forma automática por el software. En consecuencia, el porcentaje de vasos funcionales dentro de la clavija puede ser cuantificada. Alta resolución Fibered endomicroscopía confocal sirve como modalidad de imagen complementaria al informar sobre los vasos sanguíneos morfología. En este método mínimamente invasivo, las imágenes se adquieren después de la administración iv de dextrano conjugado con FITC 12. El polímero fluorescente tiñe el torrente sanguíneo y por lo tanto sirve como un "agente de contraste" para los vasos sanguíneos morfología y el flujo sanguíneo. Además, dado que el polímero inyectado es en un tamaño de 70 KDa, sólo puede atravesar los vasos con fugas como se encuentra en la vasculatura del tumor. Esto resultará en alto fondo de la dextrano marcado con FITC fuera de los vasos sanguíneos. En consecuencia, endomicroscopía confocal fibrado se puede utilizar para visualizar características típicas del efecto EPR en el tumor neovasculature- agrandados, los vasos que gotean, altamente enmarañadas-, con extremos romos.
Este modelo del sistema se descricama en la comparación del potencial angiogénico de U-87 MG glioblastoma humano y su clon inactivo 13. Vascularización dentro de los tapones se evaluó tres semanas después de la inoculación gel-ECM sinóptico. Se demostró que la vascularización dentro de tapones que contienen CM de U-87 MG de rápido crecimiento de células tumorales de generación se incrementó significativamente en términos de número, la densidad y la funcionalidad, en comparación con la vascularización dentro de los tapones que contienen CM de las células tumorales de generación latentes. Por lo tanto, los autores fueron capaces de concluir que CM aislado de U-87 MG de rápido crecimiento de células tumorales de generación contiene niveles más altos de factores pro-angiogénicos, en comparación con la CM a partir de células tumorales de generación latentes. Estos factores estimulan la formación de vasos sanguíneos funcionales al afectar positivamente todos los pasos de la cascada angiogénica (es decir, la proliferación, la brotación, la migración y, finalmente, la formación de estructuras tubulares de las células endoteliales).
Protocol
Representative Results
Discussion
Combinando métodos de imagen complementarios permite la adquisición de información sobre la densidad de microvasos, funcionalidad y morfología de los diferentes componentes de la angiogénesis. Cargando CM en los tapones de gel de ECM sinóptico genera un microambiente tumoral, que está separada de otras poblaciones de células, como las células endoteliales, que son reclutados y extravasación en el enchufe.
Mediante la realización, en paralelo, las microburbujas de contraste mejorad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
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