Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
Il sottocutanea spina dosaggio matrigel nei topi è un metodo di scelta per la valutazione in vivo di fattori pro e anti-angiogenici. In questo metodo, i fattori desiderati vengono introdotti freddo gel liquido ECM-mimico che, dopo l'iniezione sottocutanea, solidifica per formare un ambiente simulando l'ambiente cancro. Questa matrice permette la penetrazione di cellule ospiti, come le cellule endoteliali, e di conseguenza, la formazione di vasi.
Qui proponiamo un nuovo saggio spina matrigel modificata, che può essere sfruttata per illustrare il potenziale angiogenico di un pool di fattori secreti dalle cellule tumorali, al contrario di un fattore specifico (ad esempio, bFGF e VEGF) o all'agente. La spina contenente gel ECM-mimico viene utilizzato per introdurre l'host (cioè, mouse) con un pool di fattori secreti al CM di cellule di glioblastoma-tumorali generando in rapida crescita. Abbiamo precedentemente descritto un ampio confronto del potenziale angiogenicaU-87 MG glioblastoma umano e la sua dormiente derivato clone, in questo modello di sistema, mostrando angiogenesi indotta nelle cellule parentali MG U-87. Il CM è preparato filtrando mezzi raccolti da piastre di coltura tissutale confluente di entrambe le linee di cellule seguenti 48 ore di incubazione. Quindi, esso contiene solo fattori secreti dalle cellule, senza le cellule stesse. Descritto qui è la combinazione di due modalità di imaging, microbolle mdc ecografia e intravitale endomicroscopy fibered-confocale, per un accurato, in tempo reale, la caratterizzazione della misura, la morfologia e la funzionalità dei vasi sanguigni di nuova formazione all'interno delle spine.
Introduction
Il saggio angiogenesi spina matrigel è stato descritto da Kibbey et al., Nel 1992, dove è stato utilizzato per valutare la stimolazione dell'angiogenesi dal SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. A differenza di altri test angiogenesi in vivo, come l'angiogenesi corneale mouse o pulcino saggi di membrana corio-allantoidea, questo saggio è relativamente facile da eseguire 2. Il gel ECM-mimico iniettato può contenere cellule, pro-angiogenico o un composti e / o fattori anti-angiogenici. Nel valutare l'attività di un composto anti-angiogenico, il tappo contiene normalmente una miscela di vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), e la sostanza anti-angiogenico può essere somministrata direttamente nella spina o sistemica 3, 4.
Il gel ECM-mimico viene iniettato per via sottocutanea in cui si solidifica in pochi minuti. Valutazione del vaso sanguigno assunzioni nella spina risultante è typically effettuato misurando i livelli di emoglobina all'interno del plug, mediante misurazione segnale di fluorescenza dopo l'iniezione di isotiocianato di fluorescina (FITC) -labeled destrano, mediante immunocolorazione di sezioni di istologia di marcatori specifici endoteliali o da cellule fluorescenza attivate (FACS) 2,5, 6. Tuttavia, questa valutazione permette solo analisi end-point e manca informazioni sulla funzionalità e morfologia dei vasi sanguigni. Inoltre, misurazioni di volume plasmatico, sia per livelli di emoglobina o utilizzando destrano-FITC come indicatore, può essere fuorviante dal contenuto sangue è influenzata dalle dimensioni dei vasi sanguigni e la portata delle piscine stagnanti di sangue. Questo è particolarmente importante quando la vascolarizzazione assunto è caratterizzato dalla permeabilità migliorata e ritenzione (EPR) Effetto 7.
Noi qui proponiamo un nuovo, più preciso, il metodo per la visualizzazione dei vasi sanguigni reclutati dalla combinazione di due modalità di imaging complementari. Higmicrobolle h risoluzione mdc ecografia (US) in combinazione con intravitale fibrato-confocale endomicroscopy in grado di fornire informazioni non solo su sangue densità dei vasi, ma anche sulla loro morfologia e funzionalità. Inoltre, questa analisi può essere eseguita in diversi intervalli di tempo per permettere così il controllo della cinetica di angiogenesi. Stati Uniti sono un diffuso modalità di imaging che possiede alta risoluzione spaziale per i vasi sanguigni immagini seguenti per via endovenosa (ev) iniezione di microbolle che rimangono esclusivamente nel compartimento vascolare 8-11. Le microbolle sono microbolle contenenti gas che producono un forte segnale ecogena quando eccitato con un impulso degli Stati Uniti e quindi servire come un buon mezzo di contrasto. Immagini 3D della spina sono acquisiti tramite il software di sistema di imaging US seguente microbolle distruzione. Le immagini risultanti sono composti da fotogrammi dell'immagine di pre e post-distruzione delle microbolle e riflettono la differenza di intensità di video a colori. Questi sovrappostoimmagini vengono visualizzate automaticamente dal software. Di conseguenza, la percentuale di vasi funzionali all'interno della spina può essere quantificato. Alta risoluzione fibrata endomicroscopy confocale serve come modalità di imaging complementare riferendo sui vasi sanguigni morfologia. In questo metodo minimamente invasiva, le immagini vengono acquisite in seguito alla somministrazione endovenosa di destrano FITC-coniugato 12. Il polimero tinture fluorescenti nel flusso sanguigno e quindi serve come un 'agente di contrasto' per i vasi sanguigni morfologia e il flusso di sangue. Inoltre, poiché il polimero iniettato è ad una dimensione di 70 KDa, può attraversare solo navi perde come si trova nel sistema vascolare del tumore. Ciò comporterà alta sfondo dal destrano marcato con FITC fuori dei vasi sanguigni. Di conseguenza, fibrata endomicroscopy confocale può essere utilizzato per visualizzare le caratteristiche tipiche dell'effetto EPR in tumore neovasculature- allargata, che perde, le navi altamente aggrovigliati, con estremità smussata.
Questo modello di sistema è stato descriletto nel confronto tra il potenziale angiogenico di U-87 MG glioblastoma umano e la sua clone dormiente 13. Vascolarizzazione nei tappi è stata valutata tre settimane inviare ECM-mimico gel inoculazione. È stato dimostrato che la vascolarizzazione all'interno spine contenenti CM da U-87 MG rapida crescita delle cellule tumorali generando era significativamente aumentata in termini di numero, densità e funzionalità, rispetto ai tappi vascolarizzazione contenenti CM dalle cellule tumorali generare dormienti. Pertanto, gli autori sono stati in grado di concludere che CM isolato da U-87 MG rapida crescita delle cellule tumorali generando contiene livelli più elevati di fattori pro-angiogenici, rispetto al CM dalle cellule tumorali generando dormienti. Questi fattori stimolano la formazione di vasi sanguigni funzionali influenzando positivamente tutte le fasi della cascata angiogenica (cioè, la proliferazione, germinazione, migrazione e infine, formazione di strutture tubolari di cellule endoteliali).
Protocol
Representative Results
Discussion
Combinando metodi di imaging complementari consente l'acquisizione di informazioni su microvasi densità, funzionalità e morfologia diversi componenti angiogenesi. Caricare CM su spine gel ECM-mimico genera un microambiente tumorale, che è separata da altre popolazioni cellulari, come cellule endoteliali, che vengono assunti e stravaso nella spina.
Eseguendo, in parallelo, microbolle mdc US imaging e fibrata immagini endomicroscopy confocale, possiamo concludere che un pool di fattori …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
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