Automatiseret analyse af dynamiske Ca^{2 +} Signaler i billedsekvenser

Summary

Her er en roman region af interesse analyse protokol baseret på sortering bedst-fit ellipser tildelt regionerne positivt signal inden for to-dimensionelle tidsforskydningen billedsekvenser demonstreres. Denne algoritme kan gøre det muligt efterforskerne at omfattende analysere fysiologiske Ca ^{2 +-signaler} med minimal bruger input og bias.

Abstract

Intracellulære Ca ^{2 +-signaler} er almindeligt undersøgt med fluorescerende ^{Ca2 +} indikatorfarvestoffer og mikroskopi teknikker. Men kvantitativ analyse af Ca ^{2 +} billeddannelse data er tidskrævende og underlagt bias. Automatiserede signal analyse algoritmer baseret på region af interesse (ROI) detektion er blevet implementeret for endimensional line scan-målinger, men der er ingen aktuelle algoritme, der integrerer optimeret identifikation og analyse af ROIs i to-dimensionelle billede sekvenser. Her beskrives en algoritme til hurtig indsamling og analyse af ROIs i billedsekvenser. Det udnytter ellipser passer til støj filtrerede signaler for at bestemme placeringen optimal ROI og beregner Ca ^{2 +} signal parametre for amplitude, varighed og rumlig spredning. Denne algoritme blev gennemført som et frit tilgængeligt plugin til ImageJ (NIH) software. Sammen med analyse scripts skrevet til open source statistisk bearbejdning software R,Denne fremgangsmåde giver en høj kapacitet pipeline for at udføre hurtig statistisk analyse af eksperimentelle output. Forfatterne foreslår, at anvendelse af denne analyse protokol vil føre til en mere fuldstændig og objektiv karakterisering af fysiologisk Ca ^{2 +-signalering.}

Introduction

^{Ca2 +} er en allestedsnærværende anden messenger signalmolekyle og cytosoliske ^{Ca2 +-niveauer} er meget reguleret. Intracellulære Ca ^{2 +-signaler} er komplekse og omfatter isolerede transienter svingninger, og plantemateriale bølger ^{1 – 4.} Rumlig og tidsmæssig kontrol af Ca ^{2 +} menes at ligge til grund fysiologisk signal specificitet og dermed analysen af Ca ^{2 +} signalmønstre er af betydelig interesse for efterforskere i flere felter ^5.

^{Ca2 +} indikatorfarvestoffer såsom Fluo-4 og Fura-2, der almindeligvis anvendes til at måle intracellulære Ca ^{2 +-signaler} med fluorescensmikroskopi ^5-12. Typisk er timelige Ca ^{2 +} signaler evalueret som tidsafhængige ændringer i den gennemsnitlige fluorescens inden for en brugerdefineret område eller region af interesse (ROI) ^{5,6,13 – 16.} I øjeblikket analyse manuel ROI er både tidskrævende og arbejdskraft itensiv fordi det kræver, at brugerne til at identificere mange ROI'er og udføre gentagne beregninger ^17-19. Disse teknikker kan også være forbundet med en betydelig bruger fejl, herunder indførelse af kunstige signal modes og udelukkelse af lav amplitude eller diffuse signaler ^18,20.

Automatiserede ROI detekteringsalgoritmer er tidligere blevet gennemført ved anvendelse af forskellige statistiske metoder til at bestemme placeringen optimal ROI, men de har generelt været begrænset til analyse af liniescanning eller pseudo-line scan billeder, hvilket begrænser analysen til en enkelt rumlig dimension i tiden ^{17 19-22.} Derudover har mange eksisterende algoritmer ikke er tilstrækkelige til at omfatte mangfoldigheden af Ca ² release arrangementer ^+, der spænder fra periodiske, lokaliserede transienter til formerings bølger ^23,24. Omfattende evaluering af fysiologiske Ca ^{2 +-signaler} er ofte kompliceres yderligere af tilstedeværelsen af betydelige billede Artifhandle der forvirrer signal til diskrimination støj i mange eksperimentelle systemer.

Tidligere en automatiseret påvisning ROI algoritme løsning på Ca ^{2 +} signal forbigående afsløring, implementeret som et plugin til NIH ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD), blev udviklet og valideret ^25,26. Denne algoritme, kaldet LC_Pro, blev designet til at identificere og analysere ROIs omfatter Ca ^{2 +} signal transienter i to-dimensionelle tidsudløbsdata billedsekvenser. Her er en praktisk forsøgsprotokol og repræsentativ demonstration af en ansøgning af algoritmen i svine kranspulsåren endotel er forudsat, med ekstra efterbehandlingen ved hjælp af open source statistisk bearbejdning software R til at generere brugbare grafiske output.

Protocol

1.. Vessel Dissektion og Imaging Høst væv fra indenlandske juvenile grise som beskrevet i Martens et al 27. Placer høstet svin højre ventrikler i en polydimethylsiloxan (PDMS) bund dissektion skål indeholdende HEPES bufferet fysiologisk saltopløsning (PSS). Ved hjælp af et stereomikroskop, dissekere og fjerne et segment af venstre forreste nedadgående kranspulsåre (~ 8 mm længde, 0,5 mm i diameter) fra det omgivende væv ved hjælp af pincet og foråret saks ved at fjern…

Representative Results

En brugerdefineret algoritme, LC_Pro, blev udviklet og implementeret for at udføre automatiseret analyse af Ca 2 + dynamik på konfokal billedsekvenser. Som vist i figur 1, algoritmen anvender sekventielle behandling moduler, A) registrere og spore sites dynamisk Ca 2 + skifte over statistisk (p <0,01) støj, B) fastlægge områder af interesse (ROI) automatisk ved aktivt sted centre, og C) beregne gennemsnitlige fluorescensintensiteter på ROIs at fastlægge specifikke event p…

Discussion

Afkodning komplekse Ca ^{2 +-signaler} på det cellulære og flercellede niveau vil kræve strenge eksperimentelle og analytiske tilgange. Her er en tilgang, der er beskrevet i hvilken tid løst konfokal billedsekvenser af Ca ^{2 +} afhængig fluorescens underkastes en automatiseret analyse, der identificerer og kvantificerer statistisk relevante Ca ^{2 +} signaler inden intakte cellulære felter I den konkrete sag fremlagte en arterie segment blev isoleret fra gris hjerte, pinned åbnet for at b…

Materials

dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
forceps	Fine Science Tools	#11223-20
spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
cover-glass bottom chamber			Custom designed
spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
imageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing