Summary
הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.
Abstract
תאיים Ca 2 + אותות נלמדים בדרך כלל עם צבעי Ca 2 + חיווי ניאון ושיטות מיקרוסקופיה. עם זאת, ניתוח כמותי של Ca 2 + נתוני הדמיה הוא זמן רב ובכפוף למשוא פנים. אלגוריתמי ניתוח אותות אוטומטיים המבוססים על האזור של עניין גילוי (ROI) יושמו למדידות קו סריקה חד ממדי, אבל אין שום אלגוריתם הנוכחי המשלב זיהוי מותאם וניתוח של ROIs ברצפי תמונה דו ממדיים. הנה אלגוריתם לרכישה מהירה וניתוח של ROIs ברצפי תמונה מתואר. הוא מנצל אליפסות שיתאימו לאותות מסוננים רעש על מנת לקבוע את המיקום אופטימלי את ההחזר על ההשקעה, ומחשב את פרמטרי אות 2 + Ca של משרעת, משך והתפשטות במרחב. אלגוריתם זה מיושם כתוסף זמין באופן חופשי לתוכנת ImageJ (NIH). יחד עם סקריפטים ניתוח נכתבו עבור R תוכנת עיבוד הסטטיסטי הקוד הפתוח,גישה זו מספקת צינור קיבולת גבוהה לביצוע ניתוחים סטטיסטיים מהירים של תפוקה ניסיונית. המחברים מראים כי שימוש בפרוטוקול ניתוח זה יוביל לאפיון של Ca 2 + איתות פיזיולוגית שלם יותר ובלתי משוחד.
Introduction
Ca 2 + הוא שליח שני בכל מקום איתות מולקולה וCa 2 + רמות cytosolic קבועות בתקנות. תאיים Ca 2 + אותות הם מורכבים וכוללים ארעיים מבודדים, תנודות ומתפשטים גלים 4 - 1. שליטה במרחב ובזמן של Ca 2 + הוא חשב לבסיס סגוליות אות פיזיולוגית, ולכן הניתוח של 2 + דפוסי אות Ca הוא עניין רב לחוקרים בתחומים מרובים 5.
צבעי Ca 2 + מחוון כגון Fluo-4 ופורע-2 הם בדרך כלל מועסקים על מנת למדוד 2 + אותות תאיים Ca עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי 5-12. בדרך כלל, Ca 2 + אותות זמן מוערכים כשינויים תלויי זמן בקרינה ממוצעת בתוך אזור המוגדר על ידי משתמש, או באזור של עניין (ROI) 5,6,13 - 16. נכון לעכשיו, ניתוח ROI במדריך הוא גם זמן רב ועבודה בtensive מכיוון שהיא דורשת למשתמשים לזהות ROIs רבות ולבצע חישובים החוזרים על עצמן 17-19. טכניקות אלו עשויות להיות כפופות גם למשתמש שגיאה ניכרת, כוללים הקדמה של מצבי אות מלאכותיים והדרה של משרעת נמוכה או אותות מפוזר 18,20.
אלגוריתמים לזיהוי אוטומטיים את ההחזר על ההשקעה בעבר יושמו באמצעות מגוון של גישות סטטיסטיות כדי לקבוע מיקום ROI אופטימלי, אבל הם בדרך כלל היו מוגבלים לניתוח של קו סריקה או פסאודו אונליין תמונות סריקה, אשר מגבילה את הניתוח לממד מרחבי יחיד בזמן 17, 19-22. בנוסף, קיימים אלגוריתמים רבים אינם מספיקים כדי להקיף את המגוון של Ca 2 + אירועי שחרור אשר נעו בין ארעיים תקופתי, מקומי לגלים מתפשט 23,24. הערכה מקיפה של 2 + אותות Ca הפיסיולוגיים לעתים קרובות מסתבכת עוד יותר על ידי הנוכחות של artif תמונה המשמעותיתלפעול שמקעקעת אות לרעש באפליה רבות מערכות ניסיוניות.
בעבר, פתרון אוטומטי זיהוי ROI אלגוריתם לCa 2 + אות זיהוי חולף, מיושם כתוסף לתוכנת NIH ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD), פותח ומאומתים 25,26. אלגוריתם זה, הנקרא LC_Pro, תוכנן כדי לזהות ולנתח ROIs המקיפה ארעיים 2 + אות Ca ברצפי הזמן לשגות תמונה דו ממדיים. הנה פרוטוקול ניסוי מעשי והפגנת נציג יישום של האלגוריתם בהאנדותל של עורקים הכליליים חזירי מסופק, עם postprocessing נוסף באמצעות R תוכנת עיבוד הסטטיסטי בקוד הפתוח ליצירת פלט גרפי שמיש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissection כלי והדמיה
- רקמת קציר מחזירים לנוער מקומיים, כמתואר במרטנס et 27 אל. הנח חדרים תקין חזירים שנקטפו לpolydimethylsiloxane צלחת לנתיחה תחתונה המכילה HEPES נאגרו פתרון פיסיולוגי מלוח (PSS) (PDMS).
- בעזרת סטראו, לנתח ולהסיר את קטע של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (אורך ~ 8 מ"מ, קוטר 0.5 מ"מ) מרקמות באמצעות מלקחיים ומספריים באביב על ידי הסרת קטע הכלי משכבות רקמת לב שמסביב. הערה: שים לב שלא לנקב את דפנות כלי הדם.
- מניחים בלוק PDMS (1 x 0.5 x 0.5 סנטימטר) לתוך הצלחת לנתיחה, ולהשתמש במחט להצמיד אותו לתחתית. חותכים כ 40 מיקרומטר תיל טונגסטן בקוטר לשנתי עשרה מקטעים באורך 0.3 סנטימטר ~, ויצר micropins, ולמקם את אלה בצלחת. בעזרת מלקחיים, לאבטח את הקצה אחד של מגזר הכלי לבלוק עם micropin.
- בזהירות להכניס מספריים באביב קטנים לתוך לומן הכלי, וחתך אורכים בצד אחד של הכלי כדי לפתוח אותו לחלוטין. לכוון את מגזר הכלי נפתח עם האנדותל למעלה.
- השתמש micropins שנותר כדי לאבטח את הגבולות של מגזר הכלי נפתח כדי לחסום באופן שהכלי יוצר מלבן שטוח. הערה: צריכה להיות כפופות צמרות Micropin 90 ° ונוסף עד מיושר עם משטח הבלוק. יש להקפיד למתוח את הכנת הכלי ללא מתיחת יתר; רוחב סופי צריך להיות ~ 1.5x רוחב unstretched מתחיל.
- הכן את הנפח קטן (~ 1 מיליליטר) של Fluo-4 פתרון טעינת PM על ידי ערבוב Fluo-4 בבוקר (10 מיקרומטר) מומסים DMSO עם (0.03%) pluronic בHEPES נאגר PSS (המכיל במ"מ: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז), והכנס את כל הגוש לפתרון הטעינה כ 40 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- לאחר טעינה, לשטוף את הבלוק בHEPES נאגרוPSS ל5-10 דק '.
- הר האבן על 50-100 מפרידי עבים מיקרומטר בתא תחתון coverglass מכיל HEPES נאגרו PSS. הערה: פינים ממתכת יכולים לשמש כמפרידים ולהבטיח מגזר הכלי פונה כלפי מטה ולא נוגע במפרידים.
- מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה מצוידת להדמית confocal, ומתמקד בשכבת תאי האנדותל.
- רצפי הזמן לשגות תמונת לכידה של הקרינה היחסית הבסיסית ל~ 3 דקות בהגדלה 20X וקצב פריימים של ~ 8 פריימים לשנייה באמצעות תוכנת aquisition רצף תמונת confocal.
- לאחר ~ 3 דקות של הקלטת הקרינה הבזליים, להחליף HEPES נאגרו פתרון PSS עם אותו הנפח (~ 1 מיליליטר) של החומר P (100 PM) מומס בHEPES נאגרו PSS, ולהקליט עבור 3 דקות addtional.
2. ניתוח אוטומטי
- לדקלם רצף תמונה (ים) של פעילות סיד ניאון מתוכנה רכישת confocal כ8 סיביות, גרם'. Tif' קבצי rayscale תבנית עם מידע לא בקנה מידה.
- ImageJ הפתוח, לחץ על "פתוח" בתפריט הקובץ, ובחר את התמונה ברצף המתאים בחלון הסייר כדי להציג את התמונה ברצף (ים) בImageJ.
- לקבוע את ההחזר על ההשקעה בקוטר מתאים על ידי שימוש בכלי ROI המלבני להעריך את הגבולות העליונים ותחתונים של הפריסה המרחבית של פעילות בתוך רצף התמונה (ים). הערה: הקוטר המלבני הממוצע הוא בחירה מתאימה לקוטר החזר על השקעה.
- צור תיקייה חדשה בכונן הקשיח של המחשב, ולהוסיף את התמונה ברצף (ים) לתוך ספריית התיקייה.
- בImageJ, לחץ על החלון 'התוספים', ולאחר מכן לחץ על 'LC_Pro' כדי להתחיל את הניתוח.
- הזן את ערך קוטר החזר על ההשקעה ובחר את ערך סף מסנן (או 0.05 או 0.01).
- לחץ על תיבת הסימון 'הטיפול תרופתי' והזן את ערכי נקודת הזמן מייד לפני ואחרי התרופה נוספת (בשניות).
- לחץ על 'אישור', והזן את ספריית רצף התמונה לתוך חלון סייר קבצים.
3. פלט גרפי
- הורד גרסת R 3.0.2 מhttp://www.r-project.org/.
- פתח את גרסת 32 ביט של ר '
- לחץ על "קובץ", ואז "תסריט פתוח 'ובחר תסריט R' traceplot.R 'להפקת דוחות ניסיוניים גרפיים.
- התקן את הכיול, וחבילות gplots על ידי בחירה "חבילות", "התקנת חבילות", ובחירה בחבילות appropirate.
- לחץ על 'קובץ ", ואז" מדריך שינוי "הפקודה, ולהשתמש בחלון הסייר כדי לבחור את הספרייה המתאימה לפלט ניתוח LC_Pro.
- לחץ על חלון סקריפט ולאחר מכן "להפעיל את כל" הפקודה כדי להריץ את הסקריפט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אלגוריתם מותאם אישית, LC_Pro, פותח ומיושם על מנת לבצע ניתוח אוטומטי של Ca 2 + דינמיקה ברצפי תמונת confocal. כמתואר באיור 1, האלגוריתם מנצל מודולים עיבוד רציפים ש) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי 2 + לשנות מעל סטטיסטי (p <0.01) רעש, B) להגדיר אזורים של עניין (ROI) באופן אוטומטי במרכזי אתר פעילים, ו ג) לחשב את עוצמות הקרינה ממוצעת בROIs לקבוע פרמטרים אירוע ספציפיים. סקירה גרפית של האלגוריתם מוצגת באמצעות פולסים גאוס ממוחשבים של עוצמת ומיקום ידועים (איור 2). פולסים אות (2A דמויות ו-B) הוסבו לינארי באמצעות Z-הציון להתפלגות נורמלית סטנדרטית, ואליפסות מיטבית חולקו ללוקוסי פיקסל מעל סף אות (איור 2 ג). אלגוריתם מיון אליפסה שימש לdetermiמיקום ne האופטימלי את ההחזר על ההשקעה (איור 2 ד). החזר על ההשקעה מתכוונת עוצמת לעומת הזמן נמדדה מכן ופרמטרי אות של משרעת, משך זמן ופריסה המרחבית חושבו (2E איור). גישת ניתוח זה יושמה להעריך Ca הסלולרי 2 + דינמיקה בהאנדותל של כלי דם בשלמותה. באופן ספציפי, confocal הדמיה בוצעה בעורקים הכליליים חזירים נפתחו כמתואר באיור 3, והאלגוריתם הועסק מחובר לכמת Ca 2 + פרמטרים שונים. בניסויים אלה, הקלטות מתמשכים שנעשו לפני ואחרי התוספת של גירוי אנדותל, חומר P (SP; 100 PM), וניתוח LC_Pro בוצע לאחר מכן. עבור קנה מידה אות בתוך כל החזר על השקעה, תוכניות בסיסיות נגזרו כרגרסיות ליניארי של עוצמת החזר על השקעה במשך זמן הניסוי (איור 4). אומר ערכי עוצמת אות חושבו עבור כל החזר על השקעה (איור 4 א), וערכים מעל הממוצע היו TRUNC ated לממוצע ורגרסיה לינארית בוצעה משוערת בסיס אות (איור 4). לבסוף, ערכי עוצמת גלם חולקו על ידי הערך של הקו הרגרסיה להמיר ערכים לקפל שינוי לאורך קו בסיס (איור 4C). איור 5 מראה ניסוי נציג, כוללים תמונות של 2 + הקרינה תלויה Ca ב( איור 5 א) האנדותל, לצבור מסכות בינארי של Ca 2 + אות בסך הכל אותרה בתחום נדגמו (איור 5), והקלטות של הקרינה ממוצעת בכל החזר על השקעה (איור 5 ג) לפני ואחרי טיפול SP. ניתוח פרמטר שלאחר מכן בוצע באמצעות תוכנת R. היסטוגרמות וכתוצאה מכך להראות את אפקט ההגברה של SP על משרעת אירוע, משך זמן, ופריסה המרחבית (איור 6).
"Width =" 560/51560fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1. תרשים זרימת אות של תהליכי אלגוריתם (נתון זה הושג באישור פרנסיס ואח'.) 24. האלגוריתם היה מאורגן לשלושה חלקים: עיבוד תמונה, עיבוד אירוע, ואזור של עניין עיבוד (ROI). רצפי תמונה הם קלט לתוך זרימת השרשרת, וסטטיסטיקת אירוע מופקות כתוצר סופי. שגרת עיבוד תמונה () של האלגוריתם ממירה את התמונה ברצף קלט לתוך רשימה של אליפסות מיטבית על ידי קביעת ערכי סף, באמצעות Z-הציון להתפלגות נורמלית סטנדרטית וניתוח חלקיקי ImageJ. עיבוד אירוע (B) הוא שגרת מיון המשמשת לקביעת עמדת החזר על השקעה אופטימלית על ידי ארגון מקומות לאליפסה "אתרים" אירוע בזמן. לאחר אומר מדידות עוצמת נלקחות בכל החזר על השקעה, פרמטרים סטטיסטיים עבור כל אתר אירוע ומחושבים על ידי שגרת עיבוד ROI (C </ Strong>) כדי להפיק את הפלט הסופי. BKGD, רקע; AVG, ממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הפגנה של רכישה אוטומטית החזר על השקעה וזיהוי אותות באמצעות דופק גאוס מחשב שנוצר (נתון זה הותאם באישור פרנסיס ואח'.) 24. דופק מחשב שנוצר אחד אות (א ') היה מוטבע ברעש רקע אקראי. התמונה ברצף בקנה מידה אפורה מסונן כדי להסיר ערכים סטטית רקע פיקסל (B) והמיר לינארי באמצעות ערכי עוצמת פיקסל סף של P <0.05 מחושבים על ידי הציון הסטנדרטי (C). algorith ניתוח חלקיקי ImageJms אז הוחלו על רצף התמונה כדי להקצות אליפסות מיטבית ללוקוסי פיקסל בכל מסגרת. אלגוריתם רומן שימש לאליפסות קבוצה אל "אירועים" זמניים בדידים ולקבוע את המיקום האופטימלי לכל החזר השקעה המבוססת על מרכז האליפסה הממוצע (ד '). החזר על השקעה של רדיוס הגדרת משתמש ממוקם אז בכל עמדה (עיגול מקווקו). אומר ערכי עוצמה בתוך החזר על השקעה מחושבים עבור כל מסגרת ולשנותם באמצעות קירוב בסיס ליניארי. המשרעת שיא מזוהה כמקסימום מקומי מעל P <0.05 כהגדרתו על ידי הציון הסטנדרטי למעקב את ההחזר על ההשקעה מקבילה (E). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Porci פרוטוקול נתיחת לב כלילית ne. סניפי אורך מ"מ כ 0.5 קוטר מ"מ x 8 של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (תמונה 1, עיגול מקווקו) נותחו משריר הלב שמסביב. מגזרי כלי היו גזוז של רקמה הסובבת adventitial וחתכו לאורכו במספריים קטנים (תמונה 2). בשלב הבא, כלי פתחו נתלו שטוחים לבלוק PDMS באמצעות חוטים עדינים טונגסטן (תמונה 3). מגזרי כלי רכובים הועמסו עם Fluo-4 Ca 2 + צבע מחוון, שטף, ולאחר מכן הניחו בחדר הדמיה עם תחתית coverglass. תמונות נאספו בהגדלה 20X (488 לשעבר., 510.) ב8.0 מסגרות לשנייה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Width =" 0/51560fig4highres.jpg 500 "/>
איור 4. ROI אומר קירוב בסיס עוצמה. בעקבות עוצמת ממוצע לעומת מדידות זמן (קווים מלאים) לכל החזר על השקעה, את ערכי עצמת גלם הם מדורגים F/F0 בשיטת קירוב הבסיס הבא. עוצמת האות הממוצעת (קו מקווקו) בתקופת השליטה מחושבת ממשתמש שליטה מוגדרת וערכי טיפול מרווח (). עקומת עוצמת אות תלוית הזמן לאחר מכן נחתך מעל לעוצמת השליטה הממוצעת לעוצמת השליטה מתכוון לסנן פעילות מקירוב תחילת המחקר, ורגרסיה ליניארית מבוצעת על עקומת התוצאה (קווים מקווקווים) (ב). לבסוף, את ערכי עצמת גלם הם מדורגים לבסיס ליניארי ממוחשבים (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
-Together.within-page = "תמיד"> 
איור 5. נציג תוצאות מניתוח LC_Pro של בסיס ומגורה Ca 2 + דינמיקה. תמונות זמן לשגות של תמונה ברצף קלט של מרווח בסיס דגימה (פנל משמאל) ואחריו מרווח בחומרים ממכרים מגורה P דגימה (פנל, נכון ) מוצגים בגוונים אפורים. רצפי תמונת זמן לשגות של האליפסות בכושר הטובות ביותר לבסיס ומגורה מרווחים (ב) ניתנו על ידי LC_pro. לבסוף, עקומות עוצמה בקנה מידה תלויה בזמן מכל אזור ממוקם באופן אוטומטי של עניין (ROI) מוצגות (C).
איור 6. היסטוגרמותשל הפצות פרמטר מניסוי נציג (איור 4). היסטוגרמות מפרמטרים של משרעת שיא (F/F0), משך ב½ מקסימום (שניות), והתפשטות המרבית מרחבית (מיקרומטר 2) עבור שניהם השליטה (בעמודה שמאלית) ותוכן היו אירועים (בעמודה ימנית) מניסוי נציג מגורה P שניתנו באמצעות R כדי לעבד את הפלט מLC_pro באופן גרפי. יש לציין, גירוי החומר P הרחיב את מספר האירועים, וגרם לשינוי תקין משמעותי במשרעת וחציון המשך ידי מבחן מאן ויטני U (p <0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פענוח Ca 2 + אותות מורכבים ברמה התאית ורבה תאית ידרוש גישות ניסוייות ואנליטיות קפדניים. כאן, גישה מתוארת שבזמן רצפי תמונת confocal נפתרו של Ca 2 + הקרינה תלויה נתונים לניתוח אוטומטי שמזהה ומכמת Ca 2 + אותות רלוונטיים מבחינה סטטיסטית בתוך שדות סלולריים ללא פגע במקרה הספציפי שהוצגו, קטע עורק היה מבודד מלב של חזיר, הצמיד נפתח כדי לחשוף את האנדותל, עמוס Ca 2 + מחוון Fluo-4 בבוקר, נתון להדמית confocal, ומוערך עם האלגוריתם המותאם אישית LC_Pro. אלגוריתם זה נועד 1) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי 2 + לשנות מעל סטטיסטי (p <0.01) רעש, 2) מגדירים את האזורים של עניין (ROI) באופן אוטומטי במרכזי אתר פעילים, ו -3) לנתח את עוצמות הקרינה ממוצעת בROIs כדי לקבוע פרמטרים אירוע ספציפיים. הגישהמתגבר על מגבלות עיקריות של מחקר איתות ביולוגית על ידי הקטנת שגיאת משתמש ומשוא פנים, צמצום זמן ניתוח מנותק במידה רבה, ומספק אינדקס של אותות מלא על פני שדה להבחין פרופילים או דפוסי נציג. פלט מLC_Pro מעובד נוסף באמצעות תסריטי R, מתן דוחות מלאים פרמטר לניסויים נפרדים, כוללים פלט גרפי באיכות גבוהה.
כמה צעדים חשובים לביצוע נכון של הטכניקה שתוארה. הליך נתיחת הרקמות (השלב 1.1.1) חייב להתבצע בזהירות כדי להימנע מdenudation או נזק של שכבת תאי האנדותל. בנוסף, רצפי תמונה חייבים להיות בפורמט הנכון (שלב 2.1) לאזור האוטומטי של אלגוריתם העניין לעבוד בצורה נכונה. לדוגמא, אם יש מידע בקנה מידה המשויך לקובץ, אזורים של עניין יוצבו באופן שגוי על פי מיקומי פיקסל, ולא המקומות היחידה בקנה המידה. כמו כן, בחירה מחדש מתאיםגיון בקוטר של עניין הוא קריטי לביצוע נכון ניתוח אוטומטי של פעילות הניאון בתוך תמונה ברצף. ערך בקוטר קטן מדי עלול לגרום למדידות מיותרות, ואילו גדול יותר בקוטר יגרום להדרה של אותות עדינים.
החסרונות פוטנציאליים של טכניקה זו בעיקר מתייחסים לרגישות של הניתוח האוטומטי לXY משמרות ברצפי תמונה רשמו ולאותת הרוויה ו / או הלבנה, אשר עלול לגרום לתוצאות שליליות חיוביות או שקר שקר. מרחף או משמרות ממדיים ניתן לפנות ישירות דרך שימוש בתוכנות רישום ערימה וייעוד מדויק של מרווחים שבו הפרעות הם הציגו. רמות אפורות ופרמטרי קוטר החזר על השקעה יכולות גם להיות מותאמות להכנה תינתן מראש של איסוף נתונים על מנת לתקנן ערכות נתונים גולמיות.
משום שהוא משמש כגישה סטנדרטית לכל אות הקרינה דינמית, הניתוח שתואר שעותפה הוא מתאים לגוף מגוון של יישומים. בכלי הדם, בשיטה זו היא להיות מועסק להגדיר פיזיולוגית אופיינית ושיטות אות pathophysiological במיטות כלי דם מרובות תחת בסיסי ומגורה תנאי 25,26. כמו כן הוא מיושם במעקב האוטומטי של Ca 2 + גלים. סופו של דבר, ניתוח אוטומטי הגלובלי כזה יהיה ציר מרכזי מכריע בפענוח מרחב ובזמן ביו אותות מורכבים ובהקמת תא חדש ודגמים רב של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HL-085,887, HL-092,992, S10RR027535, וMOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H.
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al.
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P.
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al.
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
