गतिशील सीए के स्वचालित विश्लेषण<sup> 2 +</supछवि दृश्यों में> सिग्नल

Summary

यहाँ दो आयामी समय चूक छवि दृश्यों के भीतर सकारात्मक संकेत के क्षेत्रों को सौंपा सबसे फिट ellipses छँटाई के आधार पर ब्याज विश्लेषण प्रोटोकॉल का एक उपन्यास क्षेत्र का प्रदर्शन किया है. इस एल्गोरिथ्म व्यापक न्यूनतम उपयोगकर्ता इनपुट और पूर्वाग्रह के साथ शारीरिक सीए ^{2 +} संकेतों का विश्लेषण करने के लिए जांचकर्ताओं सक्षम हो सकता है.

Abstract

Intracellular सीए ^{2 +} संकेतों सामान्यतः फ्लोरोसेंट सीए ^{2 +} सूचक रंगों और माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि, सीए ^{2 +} इमेजिंग डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण समय लगता है और पूर्वाग्रह के अधीन है. ब्याज (आरओआई) का पता लगाने के क्षेत्र के आधार पर स्वचालित सिग्नल विश्लेषण एल्गोरिदम एक आयामी लाइन स्कैन माप के लिए लागू किया गया है, लेकिन दो आयामी छवि दृश्यों में अनुकूलित पहचान और ROIs का विश्लेषण जो एकीकृत कोई मौजूदा एल्गोरिथ्म है. यहाँ छवि दृश्यों में तेजी से अधिग्रहण और ROIs के विश्लेषण के लिए एक एल्गोरिथ्म वर्णन किया गया है. यह ellipses इष्टतम आरओआई प्लेसमेंट का निर्धारण करने के क्रम में शोर फ़िल्टर्ड संकेतों को फिट इस्तेमाल करता है, और आयाम, अवधि और स्थानिक प्रसार के सीए ^{2 +} संकेत मापदंडों गणना करता है. इस एल्गोरिथ्म ImageJ (एनआईएच) सॉफ्टवेयर के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध प्लगइन के रूप में लागू किया गया था. एक साथ खुला स्रोत सांख्यिकीय प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर अनुसंधान के लिए लिखा विश्लेषण स्क्रिप्ट के साथ,इस दृष्टिकोण प्रायोगिक उत्पादन के त्वरित सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए एक उच्च क्षमता की पाइप लाइन में हैं. लेखक इस विश्लेषण प्रोटोकॉल का उपयोग शारीरिक सीए ^{2 +} संकेतन की एक और पूरी और निष्पक्ष लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व करेंगे कि सुझाव देते हैं.

Introduction

सीए ^{2 +} अणु और साइटोसोलिक सीए ^{2 +} स्तर अत्यधिक विनियमित रहे हैं संकेत एक देशव्यापी दूसरा दूत है. Intracellular सीए ^{2 +} संकेतों जटिल होते हैं और अलग – अलग यात्रियों, दोलनों, और लहरों ¹ प्रचार में शामिल हैं ^{– 4.} सीए ^{2 +} के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण शारीरिक संकेत विशिष्टता आबाद सोचा, और इसलिए सीए ^{2 +} संकेत पैटर्न के विश्लेषण के कई क्षेत्रों ⁵ में जांचकर्ताओं को काफी रुचि है.

ऐसे Fluo 4 और Fura-2 के रूप में सीए ^{2 +} सूचक रंगों सामान्यतः प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ^5-12 के साथ intracellular सीए ^{2 +} संकेतों को मापने के लिए कार्यरत हैं. ^{16 –} आमतौर पर, अस्थायी सीए ^{2 +} संकेतों समय पर निर्भर एक उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्र के भीतर मतलब प्रतिदीप्ति में परिवर्तन, या हित के क्षेत्र (आरओआई) ^5,6,13 के रूप में मूल्यांकन कर रहे हैं. वर्तमान में, पुस्तिका रॉय विश्लेषण समय लगता है और श्रम दोनों में है^{19 –} यह कई ROIs की पहचान और दोहराव संगणना ¹⁷ प्रदर्शन करने के लिए उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता है क्योंकि तनाव बनानेवाला. इन तकनीकों में भी कृत्रिम संकेत मोड और कम आयाम या फैलाना संकेतों ^18,20 के बहिष्कार की शुरूआत सहित काफी उपयोगकर्ता त्रुटि के लिए विषय हो सकता है.

^, स्वचालित आरओआई का पता लगाने एल्गोरिदम पहले से इष्टतम आरओआई नियुक्ति निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर लागू किया गया है, लेकिन वे आम तौर पर लाइन स्कैन या छद्म लाइन समय ¹⁷ में एक भी स्थानिक आयाम के विश्लेषण प्रतिबंधित जो स्कैन छवियों का विश्लेषण करने के लिए सीमित कर दिया गया है ^19-22. साथ ही, कई मौजूदा एल्गोरिदम सीए आवधिक, स्थानीय यात्रियों से प्रचार लहरों ^23,24 को लेकर ^{2 +} रिहाई की घटनाओं की विविधता धरना पर्याप्त नहीं हैं. शारीरिक सीए ^{2 +} संकेतों के व्यापक मूल्यांकन अक्सर आगे महत्वपूर्ण छवि artif की उपस्थिति से जटिल हैकि कई प्रायोगिक प्रणाली में शोर भेदभाव करने के संकेत घालमेल कर काम करते हैं.

इससे पहले, सीए करने के लिए एक स्वचालित आरओआई का पता लगाने एल्गोरिथ्म समाधान ^{2 +} (स्वास्थ्य, बेथेस्डा, एमडी के राष्ट्रीय संस्थान), विकसित और ^25,26 मान्य किया गया था एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए एक प्लगइन के रूप में लागू किया, क्षणिक पता लगाने के संकेत. LC_Pro कहा जाता है इस कलन, दो आयामी समय चूक छवि दृश्यों में सीए ^{2 +} संकेत यात्रियों को शामिल ROIs की पहचान करने और विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किया गया था. यहाँ एक व्यावहारिक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और सुअर का कोरोनरी धमनी endothelium में एल्गोरिथ्म के एक आवेदन के प्रतिनिधि प्रदर्शन प्रयोज्य चित्रमय उत्पादन उत्पन्न करने के लिए खुला स्रोत सांख्यिकीय प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर अनुसंधान का उपयोग अतिरिक्त postprocessing साथ, प्रदान की जाती है.

Protocol

1. पोत विच्छेदन और इमेजिंग Martens एट अल 27 में वर्णित के रूप में घरेलू किशोर सूअरों से फसल ऊतक. एक polydimethylsiloxane (PDMS) HEPES शारीरिक खारा समाधान (पीएसएस) बफर युक्त नीचे विच्छेदन डिश में काटा स्वाइन सही निलय रखें…

Representative Results

एक कस्टम एल्गोरिथ्म, LC_Pro, विकसित और सीए के स्वचालित विश्लेषण करने के क्रम में लागू किया गया था confocal छवि दृश्यों पर 2 + गतिशीलता. चित्र 1 में दर्शाया के रूप में, एल्गोरिथ्म एक) का पता लगाने और गतिशील ?…

Discussion

सेलुलर और बहुकोशिकीय स्तर पर जटिल सीए ^{2 +} संकेतों Decoding कठोर प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी. इधर, एक दृष्टिकोण सीए ^{2 +} निर्भर प्रतिदीप्ति का संकल्प लिया confocal छवि दृश्यों प्?…

Materials

dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
forceps	Fine Science Tools	#11223-20
spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
cover-glass bottom chamber			Custom designed
spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
imageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing