Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l'input minimo da parte dell'utente e pregiudizi.
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Articolo metodologico
Analisi automatizzata del Dynamic Ca
In questo articolo
Sommario
Abstract
Intracellulare di Ca 2 + segnali sono comunemente studiate con coloranti fluorescenti Ca 2 + indicatore e le tecniche di microscopia. Tuttavia, l'analisi quantitativa di Ca 2 + dati di imaging è in termini di tempo e soggetto a bias. Automatizzati algoritmi di analisi del segnale in base alla regione di interesse (ROI) rilevazione sono state implementate per scansione misurazioni linea unidimensionale, ma non esiste alcun algoritmo corrente che integra identificazione ottimizzata e analisi di ROI in sequenze di immagini bidimensionali. Qui un algoritmo per acquisizione rapida e analisi di ROI in sequenze di immagini è descritto. Utilizza ellissi adattano ai segnali filtrati rumore per determinare il posizionamento ottimale ROI, e calcola i parametri del segnale Ca 2 + di ampiezza, durata e distribuzione spaziale. Questo algoritmo è stato implementato come plugin liberamente disponibile per ImageJ (NIH) software. Insieme con gli script di analisi scritti per l'open source software di elaborazione statistica R,questo approccio fornisce una pipeline ad alta capacità per l'esecuzione di analisi statistiche rapida della produzione sperimentale. Gli autori suggeriscono che l'uso di questo protocollo di analisi porterà ad una caratterizzazione più completa e imparziale di fisiologica Ca 2 + segnalazione.
Introduzione
Ca 2 + è un secondo messaggero onnipresente molecola di segnalazione e Ca 2 + citosolico livelli sono altamente regolamentati. Intracellulare di Ca 2 + segnali sono complesse e includono transitori isolate, oscillazioni e moltiplicazione onde 1-4. Controllo spaziale e temporale di Ca 2 + è pensato per essere alla base fisiologica specificità del segnale, e quindi l'analisi di Ca 2 + modelli di segnale è di notevole interesse per gli investigatori in più campi 5.
Coloranti Ca 2 + indicatore come Fluo-4 e Fura-2 sono comunemente impiegati per misurar....
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Protocollo
1. Dissezione della nave e Imaging
- Tessuto raccolto da suini giovanili nazionali, come descritto nella Martens et al 27. Posizionare raccolte ventricoli destro suina in un polidimetilsilossano (PDMS) piatto dissezione fondo contenente HEPES tamponata soluzione fisiologica (PSS).
- Con l'ausilio di uno stereomicroscopio, sezionare e rimuovere un segmento discendente anteriore dell'arteria coronaria (~ lunghezza 8 mm, diametro 0,5 mm) dal tessuto circostante con pinze e forbici molla rimuovendo il segmento del vaso dalle circostanti strati di tessuto cardiaco. NOTA: Fare attenzione a non forare la parete del serbatoio.
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Risultati
Un algoritmo personalizzato, LC_Pro, è stato sviluppato e realizzato al fine di effettuare l'analisi automatizzata di Ca 2 + dinamiche su sequenze di immagini confocale. Come illustrato nella figura 1, l'algoritmo utilizza moduli di elaborazione sequenziale a) individuare e siti di traiettoria dinamica Ca 2 + cambiare sopra statistico (p <0.01) rumore, B) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e C) il calcolo dell'intensità medi.......
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Discussione
Decodifica complessi Ca 2 + segnali a livello cellulare e multicellulare richiederà approcci sperimentali e analitici rigorosi. Qui, un approccio è descritto in cui il tempo risolti sequenze di immagini confocale di Ca 2 + fluorescenza dipendenti sono sottoposti ad una analisi automatizzata che identifica e quantifica statisticamente rilevanti Ca 2 + segnali all'interno di campi di cellulari intatti nel caso specifico presentato, un segmento di arteria è stata isolata dal cuore di ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535, e MOP-93676.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto di dissezione | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polidimetilsilossano (PDMS) | di elastomeri Fisher | Sci | #NC9644388, deve essere modellato in piastre |
| PSS Sigma | #H3375-250G | HEPES acido | |
| Stereomicroscopio | Nikon Inst. | ||
| Forcipe | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Forbici a molla | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Filo di tungsteno | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | ||
| Perni metallici | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Camera inferiore | |||
| Microscopio confocale a disco rotante | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download su: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin per imageJ | download su: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | scarica su: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | scarica su: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
Riferimenti
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S.
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Ristampe e permessi
