Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup> 2 +</sup> Signale in Bildsequenzen
Summary
Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.
Abstract
Intrazelluläre Ca 2 +-Signale sind allgemein mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikatorfarbstoffe, und Mikroskopie-Techniken untersucht. Ist die quantitative Analyse von Ca 2 +-Bilddaten jedoch zeitaufwendig und je nach Vorspannung. Automatisierte Signalanalyse-Algorithmen basieren auf Region von Interesse (ROI) Detektion wurden für eindimensionale Zeilen Messungen durchgeführt worden, aber es gibt keine aktuelle Algorithmus optimiert die Identifizierung und Analyse von ROIs in zweidimensionale Bildsequenzen integriert. Hier wird ein Algorithmus für die schnelle Erfassung und Analyse von ROIs in Bildfolgen beschrieben. Es nutzt Ellipsen passen Rauschen gefilterten Signale, um eine optimale Platzierung ROI zu ermitteln, und berechnet Ca 2 +-Signalparameter der Amplitude, Dauer und räumliche Ausbreitung. Dieser Algorithmus wurde als frei verfügbare Software-Plugin für ImageJ (NIH) durchgeführt. Zusammen mit der Analyse Skripte für die Open-Source-Software R statistische Verarbeitung geschrieben,Dieser Ansatz bietet eine Hochleistungs-Pipeline für die Durchführung schnelle statistische Analyse der experimentellen ausgegeben. Die Autoren schlagen vor, dass die Verwendung dieser Analyseprotokoll wird zu einem vollständigen und unvoreingenommene Charakterisierung der physiologischen Ca 2 +-Signal führen.
Introduction
Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül second messenger und zytosolischen Ca 2 +-Spiegel sind stark reguliert. Die intrazelluläre Ca2 +-Signale sind komplex und umfassen isolierten Transienten, Schwingungen, Wellen-und Pflanzgut 1-4. Räumliche und zeitliche Steuerung von Ca 2 + wird gedacht, um physiologische Signal Spezifität zugrunde liegen und damit die Analyse von Ca 2 +-Signalmuster ist von großem Interesse für die Ermittler in mehreren Feldern fünf.
Ca 2 +-Indikator-Farbstoffe, wie Fluo-4 und Fura-2 werden üblicherweise verwendet, um intrazelluläre Ca 2 +-Signale mit Fluoreszenzmikroskopie 5-12 messen. 16 – typischerweise werden zeitliche Ca 2 +-Signale als zeitabhängige Änderung der mittleren Fluoreszenz innerhalb einer benutzerdefinierten Bereich oder Region von Interesse (ROI) 5,6,13 ausgewertet. Derzeit ist die manuelle ROI-Analyse sowohl zeitaufwendig und arbeits inSpannender, weil es erfordert, dass Benutzer viele ROIs identifizieren und sich wiederholende Berechnungen 17-19. Diese Techniken können auch mit erheblichen Benutzerfehler, einschließlich Einführung der künstlichen Signalarten und den Ausschluss von niedriger Amplitude oder diffuse Signale 18,20.
Automatisierte ROI Erkennungsalgorithmen sind zuvor unter Verwendung einer Vielzahl von statistischen Methoden, um eine optimale Platzierung ROI ermitteln implementiert worden, aber sie haben im Allgemeinen eine Analyse der Zeilen oder Pseudo-Zeilenbilder, die Analyse auf eine einzige räumliche Dimension in der Zeit 17 begrenzt begrenzt, 19-22. Darüber hinaus sind viele bestehende Algorithmen nicht aus, um die Vielfalt der Ca 2 +-Freisetzung aus Ereignissen, die periodisch, lokalisierten Transienten ausbreitende Wellen 23,24 Bereich umfassen. Umfassende Bewertung der physiologischen Ca2 +-Signale wird oft durch die Anwesenheit von signifikanten Bild Artif komplizierthandeln, dass verwechselt Signal-Rausch-Diskriminierung in vielen experimentellen Systemen.
Zuvor eine automatisierte ROI-Erkennungsalgorithmus Lösung Ca 2 +-Signal Transientenerkennung, als Plugin für NIH ImageJ Software implementiert (National Institutes of Health, Bethesda, MD), wurde entwickelt und validiert 25,26. Dieser Algorithmus, genannt LC_Pro, wurde entwickelt, um zu erkennen und zu analysieren ROIs umfassenden Ca 2 +-Signal-Transienten in zweidimensionalen Zeitraffer-Bildsequenzen. Hier eine praktische Versuchsprotokoll und repräsentative Demonstration einer Anwendung des Algorithmus in Schweineherzkranzarterie Endothel vorgesehen ist, mit zusätzlichen Postprocessing mit der Open-Source-Software R statistische Verarbeitung zu brauchbaren grafischen Ausgabe zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entschlüsselung komplexer Ca 2 +-Signale auf zellulärer Ebene und mehrzelligen strengen experimentellen und analytischen Ansätze erfordern. Hier wird ein Ansatz beschrieben, bei dem zeitaufgelöste konfokale Bildsequenzen von Ca 2 +-abhängige Fluoreszenz an einer automatisierten Analyse identifiziert und quantifiziert statistisch relevanten Ca2 +-Signale in intakten Zellfelder Im speziellen Fall dargestellt unterworfen, wurde isoliert eine Arterie Segment aus Schweineherz, merken…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Institutes of Health unterstützt Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 und MOP-93676.
Materials
| dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| imageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
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