Automatiserad analys av dynamiska Ca<sup> 2 +</sup> Signaler i bildsekvenser
Summary
Här en ny region av intresse analysprotokoll baserat på sortering bäst-fit ellipser tilldelats regioner i positiv signal inom tvådimensionell time lapse bildsekvenser visas. Denna algoritm kan göra det möjligt för utredarna att övergripande analysera fysiologiska Ca 2 +-signaler med minimal användarinmatning och partiskhet.
Abstract
Intracellulär Ca 2 +-signaler är vanligen studeras med fluorescenta Ca2 +-indikator-färgämnen och mikroskopi tekniker. Emellertid är kvantitativ analys av Ca2 + avbildningsdata tidskrävande och föremål för bias. Automatiserade signalanalys algoritmer baserade på regionen av intresse (ROI) upptäckt har genomförts för endimensionell linje scan mätningar, men det finns ingen aktuell algoritm som integrerar optimerad identifiering och analys av ROI i tvådimensionella bildsekvenser. Här en algoritm för snabb insamling och analys av ROI i bildsekvenser beskrivs. Den utnyttjar ellipser passa till buller filtrerade signalerna för att bestämma optimal investering placering, och beräknar Ca 2 +-signalparametrar för amplitud, varaktighet och spatial spridning. Denna algoritm genomfördes som en fritt tillgänglig plugin för ImageJ (NIH) programvara. Tillsammans med analys skript skrivna för öppen källkod statistisk programvara för R,denna metod ger en pipeline med hög kapacitet för att utföra snabb statistisk analys av experimentella utgång. Författarna föreslår att användningen av denna analysprotokoll kommer att leda till en mer fullständig och opartisk karakterisering av fysiologiska Ca2 +-signalering.
Introduction
Ca2 + är en allestädes närvarande andra budbärare signalmolekyl och cytosoliska Ca 2 +-nivåer är starkt reglerade. Intracellulär Ca 2 +-signaler är komplexa och innefattar isolerade transienter, oscillationer, och föröknings vågor 1 – 4. Rumslig och tidsmässig styrning av Ca2 + tros ligga bakom fysiologisk signal specificitet, och därmed analysen av Ca 2 + signalmönster är av stort intresse för forskare inom flera fält 5.
Ca2 +-indikatorfärgämnen såsom Fluo-4 och Fura-2 används allmänt för att mäta intracellulära Ca 2 +-signaler med fluorescensmikroskopi 5-12. Normalt är tids Ca 2 +-signaler utvärderas som tidsberoende förändringar i medelvärdet fluorescens inom ett användardefinierat område eller region av intresse (ROI) 5,6,13 – 16. För närvarande är manuella ROI-analys, både tidsödande och arbets ifattande eftersom det kräver användarna att identifiera många ROI och utföra repetitiva beräkningar 17-19. Dessa tekniker kan också vara föremål för betydande användarfel, däribland införandet av artificiella signallägen och uteslutande av låg amplitud eller diffusa signaler 18,20.
Automatiserade ROI detekteringsalgoritmer har tidigare genomförts med användning av olika statistiska tillvägagångssätt för att bestämma optimal investering placering, men de har i allmänhet varit begränsad till analys av linjeavsökning eller pseudo-line skanna bilder, vilket begränsar analysen till en enda rumsdimension i tiden 17, 19 – 22. Dessutom har många befintliga algoritmer inte är tillräckliga för att omfatta den mångfald av Ca2 +-frisättning händelser som sträcker sig från periodiska, lokaliserade transienter att föröknings vågor 23,24. Omfattande utvärdering av fysiologiska Ca 2 +-signaler är ofta kompliceras ytterligare av att det finns betydande bild artifagera som förvirrar signal till diskriminering brus i många experimentella system.
Tidigare har en automatiserad ROI upptäckt algoritm lösning på Ca2 + signal gående upptäckt, genomförs som en plugin för NIH ImageJ programvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD), utvecklades och validerades 25,26. Denna algoritm, kallad LC_Pro, har utformats för att identifiera och analysera ROI omfattar Ca 2 + signaltransienter i tvådimensionella tidsförlopp bildsekvenser. Här en praktisk försöksprotokoll och representativ demonstration av en tillämpning av algoritmen i griskranskärls endotel tillhandahålls, med ytterligare efterbehandling med hjälp av öppen källkod statistisk programvara för R för att generera användbar grafiska produktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avkodning komplexa Ca 2 +-signaler på cellulär och flercelliga nivå kräver rigorösa experimentella och analytiska metoder. Här är en metod som beskrivs i vilken tid beslutade konfokala bildsekvenser av Ca2 + beroende fluorescens utsätts för en automatiserad analys som identifierar och kvantifierar statistiskt relevanta Ca 2 +-signaler inom intakta cellulära fält I det specifika fallet som presenteras, en artär segment isolerades från gris hjärta, nålas öppnas för att exp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health bidrag HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 och MOP-93.676.
Materials
| dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| imageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
