High-throughput analyse af Mammale Olfaktoriske Receptors: Måling af receptor-aktivering via luciferaseaktivitet
Summary
Olfaktoriske receptor aktivering mønstre indkode lugt identitet, men manglen på offentliggjorte data, der identificerer lugtstof ligander for pattedyr olfaktoriske receptorer hindrer udviklingen af en omfattende model af lugt kodning. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at lette højkapacitetsidentifikation af olfaktoriske receptorligander og kvantificering af receptor-aktivering.
Abstract
Lugtstoffer skabe unikke og overlappende mønstre af olfaktoriske receptor-aktivering, så en familie på cirka 1.000 murine og 400 menneskelige receptorer til at genkende tusindvis af lugtstoffer. Lugtstof ligander er blevet offentliggjort for mindre end 6% af de menneskelige receptorer 1-11. Denne mangel på data er dels på grund af vanskeligheder funktionelt udtrykker disse receptorer i heterologe systemer. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at udtrykke et flertal af det olfaktoriske receptor familien i Hana3A celler, efterfulgt af en høj-throughput vurdering af olfaktoriske receptor-aktivering ved hjælp af en luciferase reporter assay. Dette assay kan anvendes til (1) screen paneler af lugtstoffer mod paneler af olfaktoriske receptorer; (2) bekræfte lugtstof / receptor interaktion via dosisreaktionskurver; og (3) sammenligne receptor aktivering niveauer blandt receptor varianter. I vores eksempeldata blev 328 olfaktoriske receptorer afskærmet mod 26 duftstoffer. Lugtstof / receptor par med varierende respons scoringer var selektivted og testet i dosisrespons. Disse data indikerer, at en skærm er en effektiv metode til at berige for odorant / receptor par, der vil passere en dosis-respons eksperiment, dvs receptorer, der har en bona fide reaktion på et lugtstof. Derfor er denne high-throughput luciferaseassayet er en effektiv metode til at karakterisere olfaktoriske receptorer-et vigtigt skridt i retning af en model af lugt kodning i pattedyrs olfaktoriske system.
Introduction
Pattedyrs olfaktoriske system har evnen til at reagere på et utal af lugtende stimuli, der giver mulighed for påvisning og diskrimination af tusindvis af lugtstoffer. Olfaktoriske receptorer (periferi) er de molekylære sensorer, som fremsættes af de olfaktoriske sensoriske neuroner i lugtepithelet 12. Mammalian lugt anerkendelse sker gennem differentieret aktivering af regioners af lugtstoffer, og OR gen familien er omfattende, med omtrent 1.000 murine og 400 humane receptorer 12-16. Tidligere funktionelle analyser af yderste periferi i olfaktoriske neuroner og i heterologe celler har vist, at forskellige lugtstoffer er anerkendt af unikke, men overlappende ensembler af regioners 10,17-20. Matchende ligander til yderste periferi er afgørende for forståelsen af olfaktoriske kode og afgørende for at opbygge levedygtige modeller af lugtesansen. På grund af vanskeligheder, der udtrykker periferi i heterologe systemer samt det store antal af både lugtstoffer og periferi, har disse data været stort set fraværende fra field; ja, mindre end 6% af de menneskelige yderste periferi har en offentliggjort ligand 1-11. Denne protokol beskriver anvendelsen af et luciferase assay for at karakterisere lugtstof / ELLER interaktioner. Denne analyse gør det muligt for high-throughput karakterisering af yderste periferi, en opgave, der er nødvendigt for at forstå lugtstof / eller interaktioner samt udvikle en model af lugt kodning.
High-throughput studier af den yderste periferi står over for tre store udfordringer. Først blev periferi udtrykt i heterologe celler bevares i Skadestuen og efterfølgende nedbrydes i proteasomet 21,22, hvilket forhindrer den yderste periferi i at interagere med lugtstoffer i assaysystemet 23-25. Dette problem blev løst ved opdagelsen af accessoriske proteiner, der fremmer en stabil celleoverfladeekspression af en bred vifte af yderste periferi 19,26,27. Receptor-transporter-proteiner 1 og 2 (RTP1 og 2) fremme eller celleoverfladeekspression og aktivering som reaktion på lugtstof stimulation 19. Baseret på dette arbejde, var HEK293T cellermodificeres til stabilt at udtrykke RTP1 lange (RTP1L) og RTP2 receptor ekspression-forøgende protein 1, og G αolf, hvilket resulterer i Hana3A cellelinie 19,27. Desuden type 3 muskarine acetylcholin-receptor (M3-R) samvirker med den yderste periferi på celleoverfladen og forbedrer aktivering som reaktion på lugtstoffer 26. Co-transfektion af en OR med RTP1S og M3-R i Hana3A celler resulterer i robust, konsekvent og funktionelle udtryk for en bred vifte af yderste periferi på celleoverfladen 27. Andet pattedyr eller repertoirer er temmelig store. Hos mennesker, for eksempel, OR repertoire er en størrelsesorden mere talrige end smagssansen receptor repertoire, og 2 størrelsesordener mere talrige end den visuelle receptor repertoire. Selv klone et enkelt eller er en forholdsvis enkel protokol, er betydelig up-front indsats, der kræves for at generere et omfattende bibliotek. For det tredje, selv om vi ved, at i et syn, bølgelængde udmønter sig i farve ogi audition frekvens udmønter sig i tonehøjde, er tilrettelæggelsen af lugte dårligt forstået, hvilket gør det svært for forskerne at interpolere fra en repræsentativ stikprøve af lugtstoffer. Selvom der er gjort på denne front 10,28 visse fremskridt, kortet over den olfaktoriske landskab er stadig ufuldstændig. Screening titusinder af molekyler mod hundredvis af yderste periferi er en skræmmende opgave; high-throughput skærme i dette domæne kræver nøje definerede kampagner. De største resterende udfordringer er dem af logistik og omkostninger snarere end problemer forbundet med teknikken. Selvom heterolog screening ikke har været meget anvendt til at identificere ligander med akademiske grupper har et privat selskab brugt den samme teknik til at identificere ligander for 100 menneskelige yderste periferi 29. Desværre er der stadig disse data proprietære.
High-throughput luciferaseassayet beskrevet her, har flere fordele i forhold til alternative metoder anvendes til evaluering eller aktivering. Selvom ansvarses af indfødte olfaktoriske sensoriske neuroner er blevet målt ved hjælp af elektrofysiologi og calcium imaging, disse teknikker har svært ved at drille hinanden, hvilket ELLER fører til en neuron reaktion på grund af overlapningen i respons egenskaber for olfaktoriske neuroner. Selv banke-på et GFP-mærket receptortype 30,31, der leverer specifikke receptorer via adenovirus for murine olfaktoriske neuroner 32,33, eller udfører RT-PCR efter optagelser 17,24,33 kan linke optagelser til en enkelt receptor typer, disse metoder er lav-throughput og ikke egnet til store skærme. Heteroloqe screening systemer er mere skalerbar og to store former er fundet i litteraturen: cAMP pathway reportere og inositoltriphosphat (IP3) pathway journalister. Ved lugt stimulering, aktivere periferi en G αolf transduktion signaleringskaskade, som resulterer i produktionen af cyklisk AMP (cAMP) 12.. Ved co-transfektion af en ildflue-luciferase-reportergen under kontrol af acAMP-responselement (CRE), kan måles luciferase produktionen som en funktion af lugt respons, giver mulighed for kvantificering af OR-aktivering. Eller aktivering kan også være knyttet til IP3 vej ved co-udtrykker G-proteiner, såsom G α15/16 eller en G α15-olf kimære 24,25,34. Vi har valgt analysen præsenteres her baseret på tre faktorer: (1) co-ekspression af RTP1 med Rho-mærkede olfaktoriske receptorer forbedrer udtryk for olfaktoriske receptorer på celleoverfladen 19,27; (2) brug af en cAMP-responsiv reporter gen giver mulighed for måling af OR aktivering via den kanoniske anden messenger vej; og (3) assayet er velegnet til high-throughput skærme.
Denne high-throughput luciferaseassayet er anvendelig til en række undersøgelser værdifulde til området for lugtesansen. For det første kan et stort antal periferi screenes mod en enkelt lugtstof for at bestemme receptor aktivering mønster for en specific duftstof. Denne type undersøgelse identificerede OR7D4 som eller er ansvarlige for at reagere på den steroid lugtstof androstenon 8. Omvendt kan en eller screenes mod et panel af lugtstoffer for at bestemme receptor reaktionsprofil 10. Når kandidat olfaktoriske lugtstof / ELLER par er identificeret via disse skærme, kan interaktion bekræftes ved at gennemføre en dosis-respons eksperiment undersøger svaret fra OR til stigende koncentrationer af lugtstof. Dosisreaktionskurver kan også vurdere, hvordan den genetiske variation i en OR påvirker in vitro lugtstof respons 8,9,11,35, og disse undersøgelser kan udvides til interspecifikke ELLER variation, der giver mulighed for undersøgelse af receptor-evolution på tværs af arter og kausale mutationer i evolution 36,37, Endelig, dette assay kan anvendes til screening for lugt-antagonister der er i stand til at antagonisere eller reaktion på en bestemt lugtstof til en kendt lugtstof / receptor par 38,39. Sammenfattende denne høje-Throughput luciferaseassayet er anvendelig til en række undersøgelser, der vil hjælpe karakterisere eller aktivering mønstre og give en bedre forståelse af lugt kodning i det olfaktoriske system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lugtstof identitet er kodet af olfaktoriske receptor aktivering mønstre, men receptor aktivering mønstre, herunder hvilke receptorer aktiveres og i hvilken grad, er kendt for mindre end 6% af de menneskelige olfaktoriske receptorer 1-11. Bestræbelserne på at karakterisere olfaktoriske receptorer er blevet begrænset af deres arbejdsintensive metoder eller anvendelighed til kun en delmængde af det olfaktoriske receptor familien 17,23,24,33,34. Den Hana3A heterolog ekspression system understøtt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af R01 DC013339, R03 DC011373, og Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. En del af arbejdet blev udført ved hjælp af Monell chemosensory receptorsignallering Core, som støttes delvist af finansiering fra NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. Forfatterne takker C. Sezille hjælp til indsamling af data.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
