Høy gjennomstrømming Analyse av Pattedyr Olfactory reseptorer: Måling av Receptor Aktivering via Luciferase aktivitet
Summary
Olfactory reseptor aktivering mønstre kode lukt identitet, men mangel på publiserte data som identifiserer odorant ligander for pattedyr luktereseptorer hindrer utviklingen av en helhetlig modell av lukt koding. Denne protokollen beskriver en metode for å legge til rette for high-throughput identifisering av olfactory reseptorligander og kvantifisering av reseptor-aktivering.
Abstract
Dufter lage unike og overlappende mønstre av olfactory reseptor aktivering, slik at en familie på ca 1000 murine og 400 menneskelige reseptorer å gjenkjenne tusenvis av luktstoffer. Odorant ligander har blitt publisert for færre enn 6% av menneskelige reseptorer 1-11. Denne manglende data er delvis på grunn av vanskelighetene funksjonelt uttrykke disse reseptorene i heterologe systemer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å uttrykke de fleste av de olfaktoriske reseptorfamilien i Hana3A-celler, etterfulgt av high-throughput vurdering av lukte reseptor aktivering ved hjelp av et luciferase reporter-assay. Denne analysen kan brukes til å (1) skjermpaneler av odorants mot paneler av olfaktoriske reseptorer; (2) bekrefte odorant / reseptor interaksjon via dose-responskurver; og (3) sammenligne reseptor aktiveringsnivå blant reseptor varianter. I datautvalget, ble 328 olfactory reseptorer skjermet mot 26 odorants. Odorant / reseptorpar med varierende respons score var selected og testet i doserespons. Disse dataene indikerer at en skjerm er en effektiv metode for å berike for odorant / reseptor parene som vil passere en dose respons eksperiment, dvs. reseptorer som har en bona fide svar på en odorant. Derfor er dette high-throughput luciferase assay en effektiv metode for å karakterisere olfaktoriske reseptorer, en viktig skritt i retning av en modell av lukt koding i pattedyr olfaktoriske system.
Introduction
Pattedyr luktsystemet har evnen til å svare på et stort antall illeluktende stimuli, noe som åpner for deteksjon og diskriminering av tusenvis av luktstoffer. Olfactory reseptorer (ORS) er de molekylære sensorer uttrykt av olfactory sensoriske nerveceller i lukteepitelet 12. Pattedyr lukt anerkjennelse oppstår gjennom differensial aktivering av ORs av luktstoffer, og ELLER genet familien er omfattende, med omtrent 1000 murine og 400 menneskelige reseptorer 12-16. Tidligere funksjonelle analyser av ORs i olfactory nerveceller og i heterologe celler har vist at ulike dufter er anerkjent av unike, men overlappende ensembler av ORs 10,17-20. Matchende ligander til ORs er kritisk for å forstå lukte kode og viktig for å bygge levedyktige modeller av luktesans. På grunn av vanskeligheter uttrykker ORs i heterologe systemer samt det store antall både dufter og ORs, har disse dataene stort sett vært fraværende fra field; ja, færre enn 6% av menneske ORs ha publisert et ligand 1-11. Denne protokollen beskriver bruken av et luciferase assay for å karakterisere odorant / eller interaksjoner. Denne analysen gjør det mulig for high-throughput karakterisering av ORs, en oppgave som er nødvendig for å forstå odorant / ELLER interaksjoner, så vel som å utvikle en modell for lukt koding.
Høy gjennomstrømming studier av ORs overfor tre store utfordringer. Først ble ORs uttrykt i heterologe celler beholdes på akuttmottaket og senere degradert i proteasome 21,22, hindrer ORS fra samspill med luktstoffer i analysesystemet 23-25. Dette problemet ble løst ved oppdagelsen av tilbehørs proteiner som letter stabil celle-overflate uttrykk for et bredt spekter av ORs 19,26,27. Reseptor-transporter-proteiner 1 og 2 (RTP1 og 2) å fremme eller celle-overflate ekspresjon og aktivering i respons til stimulering odorant 19.. Basert på dette arbeidet, HEK293T cellene varmodifisert til å stabilt uttrykke RTP1 lang (RTP1L) og RTP2, reseptorekspresjon forbedrende protein 1, og G αolf, noe som resulterer i Hana3A cellelinje 19,27. I tillegg er den type 3 muskarine acetylcholin-reseptor (M3-R) samvirker med ORs på celleoverflaten og forbedrer aktivering i respons til odorants 26. Co-transfeksjon av en OR med RTP1S og M3-R inn Hana3A celler resultater i robust, konsekvent og funksjonelt uttrykk for et bredt spekter av ORs på celleoverflaten 27. For det andre, pattedyr ELLER repertoar er ganske stor. Hos mennesker, for eksempel, er OR repertoar en størrelsesorden mer tallrik enn gustatory reseptor repertoaret, og to størrelsesordener mer tallrik enn den visuelle reseptor repertoaret. Selv om kloning en singel eller er en relativt enkel protokoll, er betydelig opp-front innsats som kreves for å generere et omfattende bibliotek. Tredje, selv om vi vet at i et syn, overs bølgelengde i farge ogi audition frekvens settes til tonehøyde, er organiseringen av lukt dårlig forstått, noe som gjør det vanskelig for forskere å interpolere fra et representativt utvalg av dufter. Selv om noen fremgang har blitt gjort på denne fronten 10,28, kartet av lukte landskapet forblir ufullstendig. Screening titusenvis av molekyler mot hundrevis av ORs er en skremmende oppgave; high-throughput skjermer i dette domenet krever nøye definerte kampanjer. De store utfordringene som gjenstår er de av logistikk og kostnader snarere enn problemene som ligger til teknikken. Selv heterolog screening ikke har vært mye brukt for å identifisere ligander av akademiske grupper, har et privat selskap brukt samme teknikk for å identifisere ligander for 100 menneske ORs 29. Dessverre er disse dataene forblir fortrolig.
Den high-throughput luciferase-analysen beskrevet her har en rekke fordeler fremfor alternative metoder for å beregne eller aktivering. Selv om ansvaretses av innfødte olfactory sensoriske nerveceller har blitt målt ved hjelp av elektrofysiologi og kalsium bildebehandling, disse teknikkene har problemer med å erte hverandre som OR fører til et nevron respons på grunn av overlapping i responsegenskaper for olfactory nerveceller. Selv banke-i en GFP-merket reseptor type 30,31, levere spesifikke reseptorer via adenovirus overfor murine olfactory nevroner 32,33, eller utføre RT-PCR etter opptak 17,24,33 kan knytte opptak til enkelt reseptor typer, disse metodene er lav gjennomstrømning og ikke egnet for storskala-skjermer. Heterologe screening systemer er mer skalerbar, og to store former er funnet i litteraturen: cAMP veien journalister og inositol trifosfat (IP3) pathway journalister. Ved lukt stimulering, ORs aktivere en G αolf transduksjon signalering kaskade som resulterer i produksjon av syklisk AMP (cAMP) 12. Ved ko-transfeksjon av et ildflue luciferase reporter-genet under kontroll av acAMP responselement (CRE), kan luciferase produksjon måles som en funksjon av lukt respons, noe som muliggjør kvantifisering av OR aktivering. ELLER aktivering kan også være knyttet til IP3 pathway av co-uttrykke G-proteiner som G α15/16 eller en G α15-olf chimera 24,25,34. Vi har valgt den analysen som presenteres her basert på tre faktorer: (1) co-uttrykk for RTP1 med Rho-merket olfactory reseptorer forbedrer uttrykk for olfactory reseptorer på celleoverflaten 19,27; (2) bruk av et cAMP-responsive reporter-genet muliggjør måling av OR aktivering gjennom den kanoniske andre messenger sti; og (3) analyse er vel-egnet til high-throughput-skjermer.
Denne high-throughput luciferase-analysen kan anvendes på en rekke studier verdifulle til feltet av luktesans. For det første kan et stort antall ORs bli screenet mot et enkelt odorant for å bestemme reseptoraktivering mønster for en specific odorant. Denne typen studier identifisert OR7D4 som OR ansvarlig for å svare på steroidet odorant androstenon åtte. Omvendt kan en ELLER bli screenet mot et panel bestående av luktstoffer for å bestemme reseptor responsprofilen 10.. Når kandidat olfactory odorant / ELLER parene er identifisert via disse skjermer kan interaksjonen bli bekreftet ved å gjennomføre en doseresponseksperiment undersøke responsen fra OR til økende konsentrasjoner av odorant. Dose responskurver kan også vurdere hvordan genetisk variasjon i en OR påvirker in vitro odorant respons 8,9,11,35, og disse studiene kan bli utvidet til interspecific ELLER variasjon, noe som åpner for undersøkelse av reseptor evolusjon over arter og årsaks mutasjoner i evolusjonen 36,37, Endelig, denne analysen kan brukes til å screene for lukt-antagonister som er i stand til å antagonisere eller som svar på en bestemt odorant for en kjent odorant / reseptor-par 38,39. I sammendrag, denne høyeGjennomstrømming luciferase assay er aktuelt for en rekke studier som vil hjelpe karakter ELLER aktiveringsmønstre og gir en bedre forståelse av lukt koding i luktesystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Odorant identitet er kodet av olfactory reseptor aktivering mønstre, men reseptor aktivering mønstre, herunder hvilke reseptorer er aktivert og i hvilken grad, er kjent for færre enn 6% av menneskelige luktereseptorer 1-11. Arbeidet med å karakterisere luktreseptorer har blitt begrenset av deres arbeidsintensive metoder eller anvendbarhet til bare en undergruppe av lukte reseptor familien 17,23,24,33,34. Den Hana3A heterologt ekspresjonssystem støtter robust uttrykk for de fleste testede olfak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av R01 DC013339, R03 DC011373, og Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. En del av arbeidet ble utført ved hjelp av Monell chemosensory Receptor Signa Core, som er støttet, delvis ved midler fra NIH-NIDCD Kjerne Grant P30 DC011735. Forfatterne takker C. Sezille for hjelp med datainnsamling.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
