RNA Catalyst som en reporter for screening af lægemidler mod RNA redigering i trypanosomer
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Der er gjort betydelige fremskridt i fastlæggelsen af mekanismen for mitokondrie-RNA redigering i trypanosomer. Ligeledes er der gjort betydelige fremskridt med at identificere de dele af editosome kompleks, der katalyserer RNA redigering. Men det er stadig ikke klart, hvordan disse proteiner arbejder sammen. Kemiske forbindelser opnået fra en high-throughput skærm mod editosome kan blokere eller påvirke et eller flere trin i redigeringen cyklus. Derfor vil den identifikation af nye kemiske forbindelser generere værdifulde molekylære prober for dissekere editosome funktion og montage. I tidligere undersøgelser, blev in vitro redigering analyser udføres ved hjælp af radio-mærket RNA. Disse assays er tidskrævende, ineffektiv og uegnet til højt gennemløb formål. Her en homogen fluorescens-baserede "mix og måle" hammerhoved-ribozymet in vitro reporter analysen til overvågning RNA-redigering, præsenteres. Kun som følge af RNA-redigering afhammerhoved-ribozym fluorescens resonans energi overførsel (FRET) oligoribonucleotid substrat undergår spaltning. Dette vil til gengæld resulterer i adskillelse af fluorophoren fra quencheren, hvorved der frembringes et signal. I modsætning hertil, når editosome funktion hæmmes, fluorescenssignalet vil blive standset. Dette er et yderst følsomt og enkelt assay, som skulle være generelt anvendelig til at overvåge in vitro-RNA-redigering eller high throughput screening af kemikalier, som kan hæmme editosome funktion.
Introduction
Processen af RNA redigering, en post-transkriptionel mRNA modifikation, blev først opdaget i trypanosomatids 1. Siden da har et stort arbejde udført i at studere mekanismen bag RNA redigering i Trypanosoma brucei 2,3. I en række af enzymatiske reaktioner, har editosome, en kerne sammensat af omkring 20 proteiner skaber modne mitokondrielle mRNA'er for flere komponenter i den energiproducerende oxidative phosphorylering system. Rækkefølgen af katalytiske begivenheder er spaltning i kernen, uridylate (U) tilføjelse eller sletning, og ligatur, som dikteret af vejledning RNA'er (gRNAs) 4..
Ud over de centrale editosome komplekse proteiner, har en række tilbehørsprodukter faktorer også blevet identificeret 5-7. Disse proteiner er for det meste set grupperes i selvstændige komplekser. Men rækkefølgen af protein samling i kernen editosome kompleks og samspillet mønstre af kernen kompleks med tilbehøretkomplekser er endnu ikke fastlagt. Målretning RNA redigeringsprocessen i trypanosomatids kan give kemiske dissektorerne, at støtte i at studere montering og funktion af editosome kompleks. Desuden har funktionelle undersøgelser af flere editosome proteiner vist væsentlighed på tværs af forskellige livsstadier, med angivelse af deres potentiale som lægemiddelkandidater 8-12. Derfor kan de fundne hæmmere af editosome også fungere som lead forbindelser mod trypanosomatids. Det er rettidig, som lægemidler øjeblikket er til rådighed mod sygdomme forårsaget af trypanosomatid er giftige, ineffektive og dyre 13,14.
En effektiv og praktisk in vitro assay er nødvendigt at undersøge den kemiske univers for specifikke inhibitorer, der blokerer RNA-redigering. Tre assays er blevet udviklet og anvendt til at overvåge editosome aktiviteter: (a) fuld runde in vitro RNA-redigering assay 15, (b) pre-spaltes in vitro RNA-redigering assay 16,17, ennd (c) hammerhoved ribozym (HHR)-baserede assay 18. De første to assays afhængige direkte visualisering af det redigerede produkt (ATPase 6-mRNA) ved hjælp af radioaktivitet. HHR-assay anvender en modificeret version af ATPase 6-mRNA, der er modelleret til at opføre sig som et ribozym ved redigering. Den funktionelle ribozym så specifikt spalter et radioaktivt mærket RNA substrat, der tjener som en reporter. For nylig Moshiri et al. Udviklet en 'mix og måle' HHR-baserede in vitro reporter analysen til overvågning RNA-redigering, hvor det radioaktivt mærkede RNA underlaget er erstattet med en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) substrat 19. De vigtigste fordele ved dette assay, er: (a) det er en hurtig og bekvem blanding og måling type assay, da produktionen af aktivt ribozym og substrat spaltning forekomme samtidigt i det samme rør i lavt volumen (dvs. 20 ul), (b ) den undgår anvendelsen af radioaktivt mærkede materialer (c) følsomhed, der er enfforded ved fluorescens instrumentering i en mikro-titerplade format og (d) et højt signal-støj-forhold. Ved hjælp af denne analyse blev effekten af kendte RNA redigering ligase hæmmere mod renset editosome bekræftet 19. Dette eksperiment valideret assay for hurtig identifikation af RNA-redigering hæmmere, primært mod hele editosomes fra T. brucei.
Figur 1 er en detaljeret trin-for-trin skematisk af fluorescens-baserede in vitro-RNA-redigering assay. Denne protokol kan enten anvendes til overvågning af RNA-redigering in vitro eller let kan tilpasses til screening af sammensatte biblioteker af forskellige skalaer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ny high-throughput screening metode til at identificere inhibitorer mod RNA-redigering kompleks af trypanosomer blev præsenteret, tilvejebringe et nyt værktøj for lægemiddelforskning at imødegå sygdomme forårsaget af trypanosomatids. FRET-baserede ribozym assay er blevet flittigt brugt til forskellige formål 20-22; imidlertid har vi brugt kapacitet FRET-baserede ribozym assay for in vitro-overvågning af RNA-redigering aktivitet 19. Dette assay potentielt kunne tilpasses til and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
