RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
התקדמות משמעותית נעשתה בקביעת המנגנון של עריכת רנ"א המיטוכונדריה בtrypanosomes. בדומה לכך, התקדמות ניכרת נעשתה בזיהוי הרכיבים של מתחם editosome כי לזרז עריכת רנ"א. עם זאת, זה עדיין לא ברור כיצד חלבונים אלו לעבוד יחד. תרכובות כימיות המתקבלות ממסך תפוקה גבוהה נגד editosome עלולות לחסום או להשפיע שלב אחד או יותר במחזור העריכה. לכן, זיהוי של תרכובות כימיות חדשות יפיק בדיקות מולקולריות רבות ערך עבור לנתח את פונקצית editosome והרכבה. במחקרים קודמים, במבחני חוץ גופית עריכה בוצעו באמצעות RNA שכותרתו רדיו. מבחני אלה הם זמן רב, לא יעיל ואינם מתאים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, המבוסס על הקרינה הומוגני "לערבב ולמדוד" פטיש ribozyme במבחנה assay כתב לפקח על עריכת רנ"א, מוצג. רק כתוצאה של עריכת RNA שלribozyme פטיש מצע oligoribonucleotide תהודה העברת אנרגיית הקרינה (סריג) עובר מחשוף. זה בתורו גורם להפרדה של fluorophore מהמרווה ובכך לייצר אות. לעומת זאת, כאשר פונקצית editosome היא עצורה, אות הקרינה תהיה הרווה. זה assay רגיש והפשוט ביותר שצריכה להיות באופן כללי החלים על לפקח בעריכת RNA חוץ גופית או הקרנת תפוקה גבוהה של כימיקלים שיכולים לעכב את פונקצית editosome.
Introduction
תהליך עריכת רנ"א, שינוי mRNA לאחר תעתיק, התגלה לראשונה בtrypanosomatids 1. מאז, עבודה משמעותית כבר נערכה בלומדת את המנגנון עומד מאחורי עריכת רנ"א בTrypanosoma brucei 2,3. בסדרה של תגובות אנזימטיות, editosome, מורכב ליבה של כ 20 חלבונים, יוצר mRNAs המיטוכונדריה הבוגר לרכיבים מרובים של מערכת זרחון חמצוני להפקת אנרגיה. סדר אירועי קטליטי הוא מחשוף endonucleolytic, uridylate בנוסף (U) או מחיקה, וקשירה, כפי שהוכתב על ידי RNAs מדריך (gRNAs) 4.
בנוסף לחלבוני editosome המורכבים הליבה, מספר גורמי אבזר יש גם זוהה 5-7. חלבונים אלה נראים בעיקר מקובצים במתחמים עצמאיים. עם זאת, את סדר ההרכבה חלבון במתחם editosome הליבה ודפוסי האינטראקציה של מתחם הליבה עם האבזרמתחמים הם עדיין לא נקבעו. מיקוד תהליך עריכת רנ"א בtrypanosomatids עשויה לספק dissectors הכימי המסייעים בלימוד ההרכבה והתפקוד של מתחם editosome. יתר על כן, מחקרים תפקודיים בכמה חלבוני editosome הראו חיוניות פני שלבי חיים שונים, המצביע על הפוטנציאל שלהם כתרופת מטרות 8-12. לכן, מעכבים מצאו של editosome יכולים גם לפעול כתרכובות עופרת נגד trypanosomatids. זה זמן, כמו תרופות הקיימות כיום נגד מחלות הנגרמות על ידי trypanosomatid הן רעילות, לא יעילות ויקרות 13,14.
Assay יעיל ונוח במבחנה יש צורך לחקור את היקום הכימי למעכבים ספציפיים שחוסמים עריכת רנ"א. שלושה מבחני פותחו ומשמשים לניטור פעילות editosome: (א) עגול מלאה בassay עריכת רנ"א המבחנה 15, (ב) לפני שהבקיע בassay עריכת רנ"א המבחנה 16,17,nd (ג) ribozyme פטיש (HHR) מבוסס assay 18. שני מבחני הראשונים מסתמכים על הדמיה ישירה של המוצר בעריכה (ATPase 6 mRNA) עם העזרה של קרינה רדיואקטיבית. Assay מבוסס HHR משתמש בגרסה שונה של mRNA ATPase 6 שהוא מודל להתנהג כribozyme על עריכה. Ribozyme הפונקציונלי אז דווקא דבק מצע RNA רדיואקטיבי, המשרת ככתב. לאחרונה, Moshiri et al. פיתח 'לערבב ולמדוד "מבוסס HHR בassay כתב מבחנה כדי לפקח על עריכת RNA שבו מצע RNA רדיואקטיבי מוחלף בהעברת תהודה הקרינה אנרגיה (סריג) מצע 19. יתרונות העיקרון של assay זה הם: (א) זה הוא שילוב מהיר ונוח וסוג המידה של assay, כמו הייצור של ribozyme הפעיל ומחשוף מצע מתרחש בו זמנית באותו הצינור בנפח נמוך (כלומר 20 μl), (ב רגישות) זה ימנע את השימוש בחומרים שכותרתו רדיואקטיבית, (ג) שהואfforded ידי מכשור הקרינה בפורמט צלחת מייקר כייל, ואות גבוהה יחס רעש (ד). שימוש assay זה, ההשפעה של מעכבים ידועים RNA עריכת האנזים נגד editosome מטוהר אושרה 19. ניסוי זה תוקף את assay לזיהוי מהיר של מעכבי עריכת רנ"א, בעיקר נגד editosomes השלם מט brucei.
איור 1 הוא סכמטי צעד אחר צעד מפורט של בassay עריכת רנ"א מבחנה הקרינה מבוסס. פרוטוקול זה יכול לשמש לניטור עריכת RNA במבחנה או בקלות להיות מותאם להקרנת ספריות מתחם של קני מידה שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת הקרנת תפוקה גבוהה רומן לזהות מעכבים נגד מורכב עריכת RNA של trypanosomes הוצגה, מתן כלי חדש לגילוי תרופות נגד מחלות הנגרמות על ידי trypanosomatids. assay ribozyme מבוסס סריג כבר נעשה שימוש נרחב למטרות שונות 20-22; עם זאת, יש לנו מנוצלים הקיבולת של assay ribozyme מבוסס סריג לניטור במבחנה<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
