RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van het mechanisme van mitochondriale RNA editing in trypanosomen. Ook heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in het identificeren van de onderdelen van de editosome complex dat RNA editing katalyseren. Het is echter nog niet duidelijk hoe deze eiwitten samenwerken. Chemische verbindingen die wordt verkregen uit een high-throughput-scherm tegen de editosome kunnen blokkeren of invloed hebben op een of meer stappen in de montage cyclus. Daarom zal de identificatie van nieuwe chemische verbindingen waardevolle moleculaire probes voor het ontleden van de editosome functie en assemblage. In eerdere studies, werden in vitro bewerken testen uitgevoerd met behulp van radio-gelabelde RNA. Deze testen zijn tijdrovend, inefficiënt en niet geschikt voor high-throughput doeleinden. Hier, een homogene fluorescentie-based "mix en meet" hammerhead ribozym in vitro reporter assay om RNA editing bewaken, wordt gepresenteerd. Slechts als gevolg van RNA editing vande hamerhaai ribozyme een fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) oligoribonucleotide substraat ondergaat decollete. Dit resulteert in scheiding van de fluorofoor door de quencher waardoor een signaal produceert. Wanneer daarentegen de editosome functie wordt geremd, het fluorescentie signaal wordt gedoofd. Dit is een zeer gevoelige en eenvoudige test die algemeen voor monitoring van in vitro RNA editing of hoge doorvoer screening van chemische stoffen die de editosome functie kan remmen moeten zijn.
Introduction
Het proces van RNA editing, een post-transcriptionele mRNA modificatie, werd voor het eerst ontdekt in trypanosomatids 1. Sindsdien is veel werk verricht bij het bestuderen van het mechanisme achter RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In een reeks enzymatische reacties, het editosome, een kerncomplex van ongeveer 20 eiwitten creëert rijpe mitochondriale mRNAs voor meerdere componenten van de energieopwekking oxidatieve fosforylering systeem. De volgorde van katalytische gebeurtenissen is endonucleolytische splitsing, uridylate (U) toevoegen of verwijderen, en ligatie, zoals gedicteerd door gids-RNA's (gRNAs) 4.
Naast de kern editosome complexe eiwitten, een aantal toebehoren factoren ook geïdentificeerd 5-7. Deze eiwitten worden meestal gezien gegroepeerd onafhankelijke complexen. De volgorde van de proteïne assemblage in de kern editosome complex en interactiepatronen van de kerncomplex de accessoirecomplexen moeten nog worden bepaald. Gericht op de RNA bewerkingsproces in trypanosomatids kan chemische dissectors bieden die helpen bij het bestuderen van de aanmaak en functie van de editosome complex. Bovendien, functionele studies op verschillende editosome eiwitten hebben aangetoond wezenlijkheid in verschillende levensfasen, met vermelding van hun potentieel als drug targets 8-12. Daarom kunnen de gevonden remmers van de editosome ook als lead verbindingen tegen trypanosomatids. Dit is tijdig, zoals thans beschikbare middelen tegen ziekten veroorzaakt door trypanosomatid zijn giftig, inefficiënt en duur 13,14.
Een efficiënte en gemakkelijk in vitro test moet de chemische universe specifieke remmers die RNA editing blokkeren verkennen. Drie assays zijn ontwikkeld en gebruikt voor het bewaken editosome activiteiten: (a) volledig door in vitro RNA editing assay 15, (b) vooraf gesplitst in vitro RNA editing assay 16,17, eennd (c) hammerhead ribozyme (HHR)-gebaseerde test 18. De eerste twee assays afhankelijk directe visualisatie van het bewerkte product (ATPase 6 mRNA) met behulp van radioactiviteit. De HHR-gebaseerde test gebruikt een gewijzigde versie van de ATPase 6 mRNA dat wordt gemodelleerd te gedragen als een ribozym na bewerking. De functionele ribozym vervolgens splitst specifiek een radioactief gemerkt RNA substraat, die als verslaggever. Recentelijk Moshiri et al.. Ontwikkelde een "meng en meet" HHR-gebaseerde in vitro reporter assay te controleren RNA editing waarbij het radioactief gemerkte RNA-substraat wordt vervangen door een fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) substraat 19. Het principe voordelen van deze test zijn: (a) het een snelle en makkelijke mix en meet type assay, de productie van actieve ribozym en substraat splitsing plaatsvinden gelijktijdig in dezelfde buis klein volume (bijvoorbeeld 20 pi), (b ) vermijdt het gebruik van radioactief gemerkt materiaal, (c) gevoeligheid eenfforded door fluorescentie instrumenten in een micro-titer plaat formaat, en (d) een hoge signaal-ruisverhouding. Met deze test wordt het effect van bekende RNA editing ligase remmers tegen gezuiverd editosome bevestigd 19. Dit experiment gevalideerd assay voor de snelle identificatie van RNA editing remmers, vooral tegen hele editosomes van T. brucei.
Figuur 1 is een uitvoerige stap-voor-stap schema van de fluorescentie gebaseerde in vitro RNA editing assay. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bewaken RNA editing in vitro of gemakkelijk worden aangepast voor het screenen van bibliotheken van verbindingen van verschillende schalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een nieuwe high-throughput screening methode om remmers tegen de RNA editing complex van Trypanosomen identificeren werd gepresenteerd, het verstrekken van een nieuw instrument voor drug discovery aan ziekten veroorzaakt door trypanosomatids tegen te gaan. FRET-gebaseerde ribozym test wordt veelvuldig gebruikt voor verschillende doeleinden 20-22; echter, hebben we de capaciteit van FRET-gebaseerde ribozym assay in vitro volgen van RNA editing activiteit 19 gebruikt. Deze assay zou kunnen w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
