Abstract
Se ha avanzado considerablemente en la determinación del mecanismo de edición del ARN mitocondrial en tripanosomas. Del mismo modo, se ha avanzado considerablemente en la identificación de los componentes del complejo editosome que catalizan la edición del ARN. Sin embargo, todavía no está claro cómo estas proteínas trabajan juntos. Los compuestos químicos obtenidos a partir de una pantalla de alto rendimiento contra el editosome pueden bloquear o afectar a una o más etapas en el ciclo de edición. Por lo tanto, la identificación de nuevos compuestos químicos generará valiosos sondas moleculares para disecar la función editosome y montaje. En estudios anteriores, los ensayos in vitro de edición en se llevaron a cabo utilizando ARN radiomarcado. Estos ensayos consumen mucho tiempo, ineficiente e inadecuada para fines de alto rendimiento. Aquí, una basada en la fluorescencia homogénea "de mezcla y medida" reportero de ensayo martillo ribozima in vitro para monitorear la edición de ARN, se presenta. Sólo como consecuencia de la edición de ARN dela ribozima cabeza de martillo un sustrato oligorribonucleótido transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) se somete a la escisión. Esto a su vez resulta en la separación del fluoróforo de la inhibidor de la fluorescencia produciendo de este modo una señal. En contraste, cuando la función de editosome se inhibe, se apagará la señal de fluorescencia. Se trata de un ensayo altamente sensible y simple que debe ser de aplicación general para vigilar en la edición de ARN in vitro o cribado de alto rendimiento de los productos químicos que pueden inhibir la función editosome.
Introduction
El proceso de edición de ARN, una modificación post-transcripcional del mRNA, fue descubierto por primera vez en tripanosomátidos 1. Desde entonces, el trabajo sustancial se ha llevado a cabo en el estudio del mecanismo detrás de la edición de ARN en Trypanosoma brucei 2,3. En una serie de reacciones enzimáticas, la editosome, un complejo de núcleo de aproximadamente 20 proteínas, crea ARNm mitocondriales maduros para múltiples componentes del sistema de la fosforilación oxidativa de generación de energía. El orden de los eventos catalíticos es la escisión endonucleolítica, uridilato (U) adición o supresión, y la ligadura, según lo dictado por los ARN guía (gRNAs) 4.
Además de las principales proteínas editosome complejos, un número de factores accesorios también se han identificado 5-7. Estas proteínas se consideran sobre todo agrupadas en complejos independientes. Sin embargo, el orden de ensamblaje de proteínas en el complejo editosome núcleo y los patrones de interacción del complejo central con el accesoriocomplejos están aún por determinar. Orientación del proceso de edición del ARN en tripanosomátidos puede proporcionar disectores químicas que ayudan en el estudio de la asamblea y función del complejo editosome. Además, los estudios funcionales en varias proteínas editosome han demostrado esencialidad a través de diferentes etapas de la vida, lo que indica su potencial como medicamento actúa 8-12. Por lo tanto, los inhibidores de la editosome han encontrado también pueden actuar como compuestos de plomo contra los tripanosomátidos. Esto es oportuna, ya que los fármacos actualmente disponibles contra las enfermedades causadas por trypanosomatid son tóxicos, ineficiente y costoso 13,14.
Un ensayo eficiente y conveniente in vitro es necesario explorar el universo químico de inhibidores específicos que bloquean la edición del ARN. Tres ensayos se han desarrollado y utilizado para monitorear editosome actividades: (a) ronda completa en el ensayo de la edición de ARN in vitro 15, (b) pre-troceados en el ensayo de la edición de ARN in vitro 16,17, unnd ensayo 18 (c) de martillo ribozimas (HHR)-basado. Los dos primeros ensayos se basan en la visualización directa del producto editado (ATPasa 6 ARNm) con la ayuda de la radiactividad. El ensayo basado en HHR utiliza una versión modificada de la ATPasa 6 ARNm que se modela a comportarse como una ribozima en la edición. La ribozima funcional entonces hiende específicamente a un sustrato de ARN radiomarcado, que sirve como un reportero. Recientemente, Moshiri et al. Desarrolló una 'mezcla y medir' HHR-basado en reportero de ensayo in vitro para monitorizar la edición del ARN en el que el sustrato de ARN radiomarcado se sustituye con una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) sustrato 19. Las ventajas principales de este ensayo son: (a) es una mezcla rápida y conveniente y el tipo de medida de ensayo, como la producción de ribozima activa y de escisión de sustrato se producen simultáneamente en el mismo tubo en bajo volumen (es decir, 20 l), (b ) que evita el uso de materiales marcados radiactivamente, (c) la sensibilidad que es unfforded por la instrumentación de fluorescencia en un formato de placa de microtitulación, y (d) una elevada relación señal-ruido. Utilizando este ensayo, el efecto de los inhibidores de la edición de ARN ligasa conocidos contra editosome purificado se confirmó 19. Este experimento valida el ensayo para la identificación rápida de los inhibidores de la edición de ARN, principalmente contra editosomes enteros de T. brucei.
La figura 1 es un esquema detallado paso a paso del ensayo en la edición de ARN in vitro basado en la fluorescencia. Este protocolo puede ser utilizado para el seguimiento de la edición de ARN in vitro o ser fácilmente adaptado para el cribado de bibliotecas de compuestos de diversas escalas.
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Protocol
El protocolo siguiente se describe el procedimiento para realizar el ensayo de edición de ARN basado en la fluorescencia. El ensayo se puede realizar en un único tubo de PCR, 96 así-, o placas de 384 pocillos dependiendo del alcance del experimento. Posteriormente, la señal de fluorescencia se puede leer en un tiempo real, sistema de detección de PCR adecuados. El ensayo que aquí se describe en el contexto de las placas de 384 pocillos.
1. El cultivo de T. Las células brucei
- Preparar un medio de crecimiento para T. brucei células procíclico de formulario. Para 1 l de medio:
- Disolver 25,4 g de polvo SDM-79 en agua 800 ml MiliQ.
- Añadir 2 g de NaHCO3 y pH a 7,3 con 10 M de NaOH.
- Añadir agua nanopura a un volumen final de 900 ml, esterilizar filtro.
- Añadir suero fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina y solución de hemina (2,5 mg / ml) a concentraciones finales de 10% (v / v), 100 U / ml y 7,5 mg / L, respectivamente.
- Grow 300 ml de T. <em> tipo salvaje 1.7A brucei (forma procíclico) las células a 28 º C, agitando a 70 rpm a una densidad de 1,5 x 10 7 células / ml. NOTA: Esto debería producir 3 ml de editosome activa con ~ 0,5 mg de proteína total, suficiente para 600 reacciones de edición.
- Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Lavar el precipitado con 50 ml de tampón de PBSG enfriada (10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, NaCl 145 mM, y glucosa 6 mM), y girar hacia abajo las células de nuevo por centrifugación a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Aislamiento de crudo mitocondrias
NOTA: Todos los pasos deben realizarse en hielo oa 4 ° C para preservar editosome actividad.
- Resuspender las células recolectadas en 30 ml de tampón de DTE (1 mM de Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM). Utilice un homogeneizador Dounce de 40 ml estéril (previamente enfriado) para interrumpir la membrana celular por acariciar arriba y hacia abajo al menos 10 veces en el hielo. Inmediatamente después, añadir 4,3 ml de 60% de sacarosa (w / v, es decir, 1,75 M) al homogenado hasta una concentración final de 0,25 M. Se centrifuga a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C, para llevar preferentemente hacia abajo mitocondrias.
- Resuspender el sedimento mitocondrial en 4,6 ml de tampón STM (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, sacarosa 250 mM y 2 mM de MgCl 2). Añadir 13,8 l de 0,1 M de CaCl 2 y 4 l de RNasa libre de DNasa I a concentraciones finales de 0,3 mM y 9 U / ml, respectivamente. Incubar la mezcla durante 1 hora en hielo.
- Añadir 4,6 ml de tampón STE (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, sacarosa 250 mM y EDTA 2 mM) para inactivar la DNasa I. Se centrifuga a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Resuspender el sedimento en 400 l de tampón de lisis (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, KCl 100 mM, 1 mg / ml de pepstatina, DTT 1 mM, y 1x de inhibidor de proteasa completo sin EDTA) y la transferencia a un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 10% de Triton X-100 a una concentración final de 1% de unND incubar el lisado durante 15 min a 4 ° C en un rotador tubo.
- Desactive la lisado mitocondrial por centrifugación dos veces a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C; conservando el sobrenadante aclarado cada vez.
3. Editosome Purificación
- Verter 10 ml de un 10% -30% (v / v) de glicerol gradiente lineal (Tabla 1) en un tubo de ultracentrífuga usando tampón de gradiente de 2x HHE (40 mM de HEPES pH 7,9, 20 mM de Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, y 2 mM EDTA) y una máquina de gradiente, siguiendo el manual de instrucciones.
- Retire cuidadosamente 500 l de solución de la parte superior de la gradiente de glicerol y cargar suavemente 500 l de lisado mitocondrial despejado. Giran a 178.000 xg durante 6 horas a 4 ° C utilizando una ultracentrífuga.
- Recoger fracciones de 500 l secuencialmente desde la parte superior a la parte inferior del gradiente a 4 ° C. Entonces complemento congelar las fracciones usando nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.
- Recocer el molde de ADN correspondiente que contiene la secuencia complementaria a la secuencia del promotor de T7 (Tabla 2) con un oligonucleótido promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') en una relación molar 1:1 por calentamiento a 90 ° C durante 3 min y enfriamiento a TA durante al menos 10 min.
- Transcribir ARN usando un kit de transcripción in vitro siguiendo el manual de instrucciones.
- Detenga la reacción de transcripción mediante la adición de un volumen igual de 7 M tinte urea (urea 7 M, 0,05% Xileno Cynol, y 0,05% Azul de bromofenol). Ejecutar en un filtro esterilizado 9% de desnaturalización en gel de poliacrilamida (9% de acrilamida, 7 M urea, 1x TBE).
- Utilice la sombra la luz ultravioleta (UV) con una lámpara UV de onda corta para localizar e impuestos especiales correspondiente ARN. Coloque la pieza de gel escindido en un tubo de microcentrífuga y añadir 400 l de tampón de elución en gel (20 mM de Tris-HCl pH 7,5, mM de NaOAc 250, EDTA 1 mM y 0,25% de SDS). Eluir noche a temperatura ambiente en un mezclador de tubo.
- PreciPitate el ARN se eluyó mediante la adición de 1 ml de etanol frío al 100% e incubando ya sea a -80 ° C durante 30 min o -20 ° C durante la noche.
- Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C, para sedimentar por la ARN.
- Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 75%. Centrifugar a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Resuspender el sedimento de ARN apropiadamente en RNasa libre de agua para alcanzar las concentraciones deseadas, como se muestra en la Tabla 2.
5. Ensayo Edición de ARN basados en fluorescencia
- Para una sola reacción, combine 1 pmol (1 l) de preA6Rbz y 2,5 pmol (1 l) de gA6Rbz (relación molar 1:2,5) en un tubo de microcentrífuga, se incuba a 70 º C durante 3 minutos y dejar reposar a temperatura ambiente durante al menos 10 min.
- Mientras tanto preparar una mezcla maestra usando la Tabla 3, sin la preA6Rbz y gA6Rbz, para la reacción de edición que contiene tampón 1x HHE (25 mM de HEPES pH 7,9, 10 mM de Mg (OAc) 2, KCl 50 mM y EDTA 10 mM), 1 mMATP, 5 mM de CaCl2, 16 ng / l de ARN de levadura Torula, 0,1% de Triton X-100, y la editosome purificada.
- Añadir recocido preA6Rbz y gA6Rbz para completar la mezcla maestra.
- Dispensar 18 l de la mezcla maestra (Tabla 3) en los pocillos que contenían ya sea 2 l de agua libre de RNasa (pocillos sin compuestos) o 2 l de 200 compuestos químicos y M incluir muestras de control en la placa de acuerdo con la Figura 5.
- Sellar la placa con un sellador de placas y hacer girar el plato, para eliminar cualquier burbuja de aire. Se incuba a 28 ° C durante 4 horas.
- Añadir 25 pmol (2 l) de gA6Rbz competidor a cada pocillo. Colocar un sellador fresco, girar la placa de abajo y colocarlo en una máquina de PCR en tiempo real. Programar el siguiente experimento:
Paso 1: 85 º C durante 5 min; Paso 2: 24 ° C durante 10 min; Paso 3: Detener. - Añadir 15 pmol (1 mu l) de sustrato de FRET a cada pocillo para un volumen final de 23 l. Sellar la placa con un sellador fresco.Girar rápidamente la placa y vuelva a colocarlo en la máquina en tiempo real PCR.
- Programe un nuevo experimento con los siguientes pasos:
Paso 1: 37 º C durante 1 min; Paso 2: Lee; Paso 3: Vaya al Paso 1, 40 veces; Paso 4: Detener. - Configuración de la placa mediante la selección de todos los pozos que requieren la lectura y eligen el filtro FAM. El volumen de entrada de hasta 23 l y empezar la carrera.
- Calcular la pendiente de los valores obtenidos a partir de cada pocillo / muestra para obtener una medición cinética por el trazado de las pistas en un gráfico de barras para el análisis. NOTA: Una lectura cinética mejora la relación señal a ruido entre la muestra y el fondo; como el fondo de la muestra tendría una pendiente cercana a cero. Una lectura de punto final tiene un mayor ruido de fondo.
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Representative Results
Para demostrar los pasos necesarios para la creación de una pantalla de gran escala, las figuras 2-5 son experimentos de control representativos relacionados con la calidad del ensayo. Estos son experimentos de control esenciales para un ensayo consistente a lo largo de varios días de cribado o para la comparación de diferentes pantallas.
La evaluación de la relación señal-ruido de fluorescencia
Para garantizar la estabilidad y la calidad del sustrato oligorribonucleótido marcado con fluoresceína en una configuración a gran escala, Z '-factor de, definido como la diferencia entre el fondo del ensayo y la señal máxima se calculó utilizando la molécula de ribozima activa (A6Rbz). . Ensayos con Z 'factor> 0,5 se consideran aceptables para la pantalla de alto rendimiento La figura 2 muestra los datos representativos utilizando el sustrato de FRET marcado con 5' con fluoresceína (FAM; emisor) y 3 'N, N'-tetrametilbencenothylrhodamine (TAMRA; inhibidor de la fluorescencia) (A6Rbz_F / T). Este sustrato produjo un Z 'factor de 0,64 cuando se calcula utilizando 72 réplicas en la presencia y ausencia de A6Rbz.
En este ensayo un sustrato alternativo usando Iowa Negro extintor oscuro (A6Rbz_F/Ib) puede producir una mejor relación señal-ruido en comparación con TAMRA. Esto se debe a Iowa Negro, a diferencia de TAMRA, emite la energía absorbida en forma de calor y no luz. La Z 'factor obtenido utilizando el FAM / Iowa Negro (F / Ib) marcado sustrato fue 0,68. La mejora en el Z '-factor para el sustrato marcado-Ib F / sobre el sustrato marcado con TAMRA es debido a su fondo relativamente menor. Estos resultados representativos muestran que ambos sustratos son opciones viables para su uso en una pantalla de alto rendimiento.
La determinación de las actividades de edición de glicerol gradiente fracciones
Para determinar y seleccionar las fracciones editosome más activos para los experimentos, la gliceroL fracciones de gradiente se probaron para la edición in vitro utilizando el ensayo basado en la fluorescencia (Paso V). Estos datos muestran (Figura 3) fracciones 7-12 como las fracciones más activas (≥ 50% la actividad de edición; con la fracción más activa como 100%). Estas fracciones se pueden combinar cuando se requiere más editosome.
Cálculo del factor de Z '-cuando las fracciones se combinaron editosome
Para determinar el efecto de la fracción combinig editosome, se calculó el valor Z 'factor de 0,6 cuando se utilizaron las fracciones más activas (F8 F9 + + F10) como la fuente de editosome. Para calcular el factor Z '72 repeticiones se probaron en presencia y ausencia de la editosome (Figura 4). El sustrato F / Ib se utilizó en este experimento. Estos datos muestran que la base de la Z '-factor de, la combinación de las fracciones de gradiente de glicerol tienen un efecto mínimo sobre la calidad del ensayo.
culo = "jove_content"> Experimento de Control Representante para el ensayo
Los datos representativos que comparan diferentes muestras de control se utilizaron para analizar las variables en el ensayo. Como se muestra en la Figura 5, las reacciones que faltan los componentes de edición de ARN (reacciones 1-4) no escinden el sustrato. La escisión del sustrato tal como se mide por la actividad de edición de fluorescencia relativa y sólo se observó en la presencia de todos los componentes de las reacciones de edición en la ausencia de un inhibidor (reacción 5) o en la presencia de todos los componentes de edición y un compuesto inactivo (reacción 6). En contraste, un compuesto inhibidor puede bloquear la edición de ARN y se utiliza como control positivo (reacción 7). Aquí, negro mordiente (MrB) y compuestos C53 se utilizaron como los controles positivos y negativos, respectivamente.
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Figura 1. Hammerhead en el ensayo de la edición de ARN in vitro a base de ribozima. A) Representación esquemática Paso a paso de la edición en el ensayo in vitro basado en la fluorescencia: (a) La hibridación del ribosoma cabeza de martillo pre-editado (A6Rbz pre-editado), con su guía de ARN (gA6Rbz). (B) El reconocimiento y la interacción del dúplex de ARN por el complejo editosome purificada. (C) Supresión de edición de RNA catalizada por la editosome. (D) disociación del A6Rbz editado desde el editosome y gA6Rbz por calentamiento a 85 ° C y adición de ARN competidor guía (gA6Rbz_comp). (E) La hibridación del sustrato de FRET con la activa ribozima hammerhead A6 (A6Rbz activo). (F) detección de las señales de FAM Después de la escisión del sustrato de FRET por la ribozima activa. B) La ribozima de cabeza de martillo de pre-editado (pre-editado A6Rbz) se muestra en asociación con gA6Rbz que especifica la supresión de tres de nosotros (arro-dos puntasW) desde el sitio de edición (ES). Como resultado de la edición del ARN en presencia de editosome funcional la ribozima inactiva se edita en su forma activa (A6Rbz editado) que ahora se puede escindir el sustrato de FRET (sitio de escisión se indica por una flecha). La conserva se resalta 5'-CUGA-3 'de la A6Rbz editado en el núcleo catalítico esencial para la actividad ribozima (sitio editado) (Esta cifra se ha modificado desde Moshiri 19). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Relación señal-ruido de comparación de proporciones entre los sustratos de FRET que albergan diferentes extintores. Ribozima (A6Rbz) la actividad usando FAM / TAMRA (F / T) y FAM / Iowa Negro FQ (F / Ib) sustratos. El represe eje ynts fluorescencia unidad arbitraria (FAU) por minuto.
Figura 3. Actividad de la edición de ARN de seleccione fracciones obtenidas a partir de glicerol gradiente de centrifugación del lisado mitocondrial. Fracción # 9 (F9) tiene la mayor actividad. El eje y representa la actividad de edición relativa en porcentaje, considerando F9 como 100%.
Figura 4. Cálculo Z '-factor de uso de las fracciones más activas (F8 F9 + + F10) como la fuente editosome. Variación experimental se obtuvo a partir de 72 repeticiones de cada tipo de reacción. Z '-factor se calcula como 0.6. El eje y representa la actividad relativa de edición.
Figura 5. Experimento representativo para el ensayo de la edición de ARN basado en la fluorescencia. Las reacciones se realizaron en un volumen final de 20 l por pocillo y en tiempo real sistema de detección de PCR CFX384 TouchTM se utilizó para medir la señal de fluorescencia. El gráfico presenta diversos controles, además de una reacción de edición completa que contiene todos los componentes para el ensayo (# 5). La fluorescencia se midió en presencia de sustrato de FRET solo (# 1) para evaluar la integridad del sustrato. Muestra # 2 se llevó a cabo en ausencia de la editosome para supervisar cualquier actividad ribozima antes de la edición. Para evaluar el efecto de editosome desnaturalizada sobre el sustrato, se midió la fluorescencia en presencia de la editosome y sustrato de FRET solo (# 3). Para probar la especificidad de edición de guía-dirigido, un Samplo en ausencia de gA6Rbz se utilizó (# 4). A no inhibidor (C53, n º 6) y un compuesto inhibidor (MrB, # 7) se utilizaron para probar el efecto en el ensayo de la edición. Mientras que la edición de ARN se inhibe significativamente por MrB, C53 tiene un efecto insignificante. Las barras de error corresponden a una variación experimental (desviación estándar) entre 10 repeticiones. El eje y representa la actividad de edición relativa en porcentaje, considerando la reacción completa (# 5) como 100%.
| 10% | 30% | |
| Búfer gradiente 2x HHE | 5 ml | 5 ml |
| Glicerol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H 2 O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 l | 10 l |
Tabla 1. 10% y 30% de solución de glicerol (10 ml cada uno).
| Pre-editado A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| molde de ADN preA6Rbz | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz ARN | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| ARN de stock conc. | 1 M |
| Guía A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| molde de ADN gA6RBz | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz ARN | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| ARN de stock conc. | 2,5 M |
| Guía A6 Ribozyme competidor (gA6RBz_comp) | |
| molde de ADN gA6Rbz_comp | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp ARN | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| ARN de stock conc. | 12,5 M |
| Activo A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz plantilla de ADN | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz ARN | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| ARN de stock conc. | 1 M |
| FRET sustrato | |
| TAMRA extintor | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Extintor Iowa Negro | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Negro-3 '(IDT) |
| ARN de stock conc. | 15 M (para ambos) |
Plantillas Tabla 2. ADN y ARN sustratos.
| Composición | Edición de reacción (l) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 M de CaCl 2 | 1 |
| ATP 100 mM | 0.2 |
| 10% Triton X-100 | 0.2 |
| 500 ng / l Levadura Torula ARN | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNasa H 2 O gratis | 7.1 |
| 1 M preA6Rbz | 1 |
| 2,5 M gA6Rbz | 1 |
| Total | 18 |
Tabla 3. Composición de Reacción y Master Mix.
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Discussion
Un método de cribado de alto rendimiento novedoso para identificar inhibidores contra el complejo de la edición de ARN de tripanosomas se presentó, proporcionando una nueva herramienta para el descubrimiento de fármacos para combatir enfermedades causadas por los tripanosomátidos. Ensayo FRET basado ribozima-ha sido ampliamente utilizado para diferentes propósitos 20-22; Sin embargo, hemos utilizado la capacidad de ensayo de ribozima basada en FRET para el control in vitro de la actividad de la edición de ARN 19. Este ensayo potencialmente podría ser adaptado a otros tipos de edición de ARN en eucariotas, tales como edición de sustitución de nucleótidos de ARN núcleo codificada de mamíferos 23.
La novedad de este ensayo no es en el establecimiento de ensayos de ribozima basados en FRET per se, sino en el desarrollo de un método que incorpora esta técnica en un ensayo de la edición de ARN que es susceptible de cribado de alto rendimiento de los productos químicos contra editosome. El método de ensayo basado-ribozima tiene varias ventajas sobre otras pantallas y culoAYS actualmente utilizados para este propósito. Específicamente, la técnica ofrece un ensayo sensible y reproducible "mezcla y medida" depender de un sustrato fluorescente en lugar de un uno radiomarcado, haciendo por ello apto para cribado de alto rendimiento 19. Monitoreo en tiempo real de una señal de fluorescencia después de la adición del sustrato en lugar de una señal de punto final simple hace posible determinar con más precisión los valores de IC50 de los compuestos ensayados 19. Además, permite verificar los efectos inhibidores de los compuestos sobre el complejo entero-editosome en oposición a las proteínas recombinantes individuales. Dada la naturaleza dinámica de las interacciones dentro de los complejos de proteínas, se puede sugerir que este método permite la identificación de inhibidores contra editosome proteínas en un representante más biológicamente establecer 24. Además, la orientación del complejo entero editosome proporciona una oportunidad para detener potencialmente la progresión de la edición de ARNen varias etapas transitorias que no han sido identificados previamente. Por lo tanto, la técnica permitirá la obtención de una mejor perspectiva como a las interacciones y actividades que son cruciales para el proceso de edición de ARN. Este enfoque se ha encontrado para tener éxito en el pasado como se ejemplifica en la elucidación de montaje complejo ribosoma procariota y función de la utilización de antibióticos, tales como eritromicina y viomicina, en calidad de inhibidores del complejo de 24,25.
Para garantizar el éxito del método, ciertos ajustes en los protocolos pueden ser necesarios. En primer lugar, la selección de la fracción de extracto mitocondrial gradiente de glicerol adecuado es crucial. Aquí, las fracciones 7 a través de 11, correspondiente a la región ~ 20S del gradiente, mostró la mayor actividad de edición, con la fracción 9 que exhibe actividad máxima. Aunque se seleccionó esta fracción para todas las pruebas presentadas, es esencial para probar todas las fracciones de antemano con el fin de evaluar en el que FRAcción de los picos de actividad de edición. En segundo lugar, para validar la selección fracción, es crítico para llevar a cabo pruebas preliminares para evaluar la relación señal-ruido mediante el cálculo del valor Z '-factor. Si apropiada mitocondrial glicerol extracto de gradiente de fraccionamiento se ha completado, un Z '-valor de 0,6 se puede lograr. A continuación, se recomienda volver a evaluar el volumen de reacción de extracto mitocondrial necesario para alcanzar la actividad máxima de edición a través de la titulación 19.
Una limitación importante de la técnica presentada en este documento se refiere al proceso laborioso y requiere mucho tiempo de mitocondrial fraccionamiento gradiente de glicerol extracto mediante el cual el complejo editosome se purifica 19. A pesar de estas desventajas, esta técnica se sugiere preferentemente para obtener fracciones de crudo editosome dado su bajo coste en comparación con el potencial de rendimiento, por lo tanto la calificación para la aplicación de cribado de alto rendimiento. En contraste, otros métodos tales como TAP-etiqueta de la PUrificación, que son capaces de dar fracciones editosome más purificadas, son aconsejables para la baja de los ensayos de rendimiento medio como en el caso de ensayos secundarios. Por otra parte, con el fin de garantizar un efecto inhibidor específico de compuestos, es necesario incluir controles para poner a prueba contra la actividad de ribozima (A6Rbz) en ausencia de la editosome. Cabe señalar que los estudios anteriores han puesto de manifiesto que este método puede ser ineficaz en el cálculo de los valores de CI50 para los compuestos de tinte como debido a la posible interferencia en concentraciones de compuesto de alto 19.
Para aumentar aún más la sensibilidad de la técnica HTS presentado, el desarrollo de un ensayo basado en la fluorescencia similar que implica pre-escindido ribozima de pre-editado es beneficioso. Esto permitiría pasar por la etapa de escisión endonucleolítica limitante de la velocidad catalizada por endonucleasas en el complejo editosome. Otra ventaja de este ensayo modificado sería la aplicación como herramienta de cribado secundariapara controlar el efecto de los inhibidores de la identificados a través de la pantalla principal en ExoUase, TUTase y actividades catalíticas de ligación. El ensayo actualmente propuesto se limita a la detección de inhibidores contra el tipo de supresión de la edición de ARN. Por lo tanto, otra vía para explorar sería la modificación del ensayo presentado para habilitar la supervisión de los efectos del compuesto sobre el tipo de inserción de la edición de ARN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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