Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopamine (DA) neuronen te vinden in verscheidene hersengebieden, waaronder de middenhersenen, hypothalamus, retina en reukkwabben. De A9 DA neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc) controle gedrag en beweging door het projecteren naar het striatum in de voorhersenen en de vorming van het extrapiramidale motorische systeem. Degeneratie van de A9 DA neuronen leidt tot de ziekte van Parkinson (PD), dat is de tweede meest voorkomende menselijke neurodegeneratieve aandoening en op dit moment ongeneeslijk. Vervangende Celtherapie is een van de meest veelbelovende strategieën voor de behandeling van PD 1, derhalve is er een grote belangstelling voor het afleiden A9 DA neuronen tegen humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geweest, zowel humane embryonale stamcellen (hESCs) en recente humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs).
Veel onderzoek is geprobeerd om A9 DA neuronen ontlenen hPSCs met behulp van verschillende methoden. De eerste rapporten alle gegenereerde DA neuronen via een neuralerozet voorlopercellen podium. Door co-kweken met MS5 2 of PA6 3-5 stromale cellen met of zonder externe groeifactoren voor 2-4 weken, L. Studer en collega's en drie andere groepen met succes geïnduceerde hESCs neurale rozetten produceren. Vervolgens verrijkt deze rozetten met mechanische ontleding of enzymatische digestie voor verdere differentiatie. In andere rapporten, onderzoekers gegenereerd neurale rozetten door embryoid lichaam (EB) drijvende cultuur differentiatie 6-9. Later, onderzoekers werd een monolaag gebaseerd differentiatie werkwijze 10,11, waar ze uitgeplaat hESCs en hiPSCs op extracellulaire matrix, verschillende groeifactoren toegevoegd aan de kweek tot de differentiatie van hPSCs DA neuronen, die de in vivo embryonale DA neuron ontwikkeling nabootst induceren . Hoewel al deze studies verkregen tyrosine hydroxylase (TH) -expressie cellen met een aantal kenmerken van DA neuronen, het hele proces van differentiatie is tijd en arbeid consumeren,algemeen inefficiënt, en nog belangrijker, werden de A9 identiteit van deze neuronen niet aangetoond in de meeste studies behalve degene met LMX1a ectopische expressie 12. Onlangs is een nieuwe vloerplaat (FP) gebaseerde protocol ontwikkeld 13-16, waarbij de FP voorlopers met DA neuron potentiële eerst werden gegenereerd door activering van de sonic hedgehog en Wnt signaalpaden in een vroeg stadium van differentiatie, en deze FP cellen werden verder gespecificeerd naar DA neuronen. Hoewel dit protocol efficiënter, zijn er nog problemen; bijvoorbeeld, de hele differentiatieproces kost tijd (ten minste 35 dagen) en feeder celafhankelijke 15, of EB afhankelijk 16 of A9 identiteit niet aangetoond 14.
Hier, op basis van de kennis van in-vivo embryonale DA neuron ontwikkeling en de gepubliceerde resultaten van andere onderzoekers, we hebben de kweekomstandigheden voor de eff geoptimaliseerdeicient generatie DA neuronen van zowel hESCs en hiPSCs. We hebben eerst gegenereerd FP voorloper cellen door activering van het Wnt-signalering met op kleine moleculen CHIR99021 en sonic hedgehog signalering met kleine moleculen SAG en purmorphamine. Deze FP-cellen brengen FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 en nestine. We hebben toen aangegeven deze FP cellen naar DA neuronen met groeifactoren zoals BDNF, GDNF, etc. De gegenereerde DA neuronen van A9 celtype als ze positief voor GIRK2 maar negatief voor Calbindin 17. Dit protocol is feeder cel of EB onafhankelijke, zeer efficiënte en reproduceerbaar. Met dit protocol kan men afleiden DA neuronen in minder dan 4 weken van hESCs of hiPSCs normale personen voor celtransplantatie, of hiPSCs PD patiënten in vitro modellen van PD of testen van potentiële therapeutische middelen voor PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humane pluripotente stamcellen (zowel hESCs en hiPSCs) kunnen worden gedifferentieerd in vitro te genereren meeste, zo niet alle celtypen van het lichaam waaronder DA neuronen, die is aangetoond in eerdere studies 19. Hier, op basis van kennis van embryonale dopaminerge ontwikkeling 20 en gepubliceerde protocollen van andere laboratoria 14,15, optimaliseerden we de kweekomstandigheden voor de productie van DA neuronen in hESCs en hiPSCs. Dit protocol is efficiënt, reproduceerba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
