Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminérgico (DA), las neuronas se pueden encontrar en varias regiones del cerebro, incluyendo el cerebro medio, el hipotálamo, la retina y bulbos olfativos. Las neuronas A9 de DA en la substantia nigra pars compacta (SNpc) controlar el comportamiento y el movimiento mediante la proyección en el cuerpo estriado en el cerebro anterior y formando el sistema motor extrapiramidal. La degeneración de las neuronas DA A9 conduce a la enfermedad de Parkinson (PD), que es el segundo trastorno neurodegenerativo más común humano y actualmente incurable. Terapia de reemplazo celular es una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de la EP 1, por lo tanto, ha habido un gran interés en la obtención de las neuronas DA A9 a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y el células recientes de origen humano madre pluripotentes (hiPSCs).
Muchas investigaciones han tratado de derivar neuronas DA A9 de hPSCs utilizando diversos métodos. Los primeros informes de todas las neuronas DA generados a través de una neuraletapa progenitor roseta. Por co-cultivo con MS5 2 o PA6 3-5 células estromales con o sin factores de crecimiento externo para 2-4 semanas, L. Studer y colegas y otros tres grupos inducidos con éxito hESCs para producir rosetas neuronales. A continuación, enriquecidos estas rosetas por la disección mecánica o digestión enzimática para su posterior diferenciación. En otros informes, los investigadores generaron rosetas neuronales a través del cuerpo embrioide (EB) la diferenciación de la cultura 6.9 flotantes. Más tarde, los investigadores establecieron un método de diferenciación monocapa basada 10,11, donde se sembraron hESCs y hiPSCs en matriz extracelular, añadieron diferentes factores de crecimiento en el cultivo para inducir la diferenciación de hPSCs a las neuronas DA, que imita el desarrollo in vivo de las neuronas DA en embrionario . Aunque todos estos estudios obtuvieron tirosina hidroxilasa (TH) células que expresaban con algunas características de las neuronas DA, todo el proceso de diferenciación es que consume tiempo y trabajo,generalmente ineficientes, y más importante, la identidad A9 de estas neuronas no se demostró en la mayoría de los estudios, excepto el uno con LMX1A expresión ectópica 12. Recientemente, una nueva placa de piso (FP) basada en protocolo se desarrolló 13-16, en el que los precursores de PF con potencial de neuronas DA se generaron por primera vez por la activación de la erizo sónico y las vías canónicas de señalización Wnt durante la etapa temprana de la diferenciación, y luego estas células de PF se especificaron aún más a las neuronas DA. Aunque este protocolo es más eficiente, todavía hay algunos problemas; por ejemplo, todo el proceso de diferenciación toma mucho tiempo (al menos 35 días) y es alimentador celular dependiente 15, o es dependiente de EB 16 o la identidad A9 no se demostró 14.
Aquí, a partir del conocimiento de in vivo el desarrollo de las neuronas DA embrionario y resultados publicados de otros investigadores, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la efciente generación de neuronas DA de ambos hESCs y hiPSCs. Se generó por primera vez las células precursoras FP por la activación de la señalización de Wnt canónica con la pequeña molécula de CHIR99021 y sonic hedgehog de señalización con moléculas pequeñas SAG y purmorphamine. Estas células expresan FP FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 y Nestin. A continuación, especificamos estas células FP a las neuronas DA con factores de crecimiento incluyendo BDNF, GDNF, etc. Las neuronas DA generados son del tipo de células A9 ya que son positivos para GIRK2 mientras negativo para Calbindin 17. Este protocolo es de células de alimentación o EB independiente, altamente eficiente y reproducible. El uso de este protocolo, se puede derivar neuronas DA en menos de 4 semanas a partir de hESCs o hiPSCs de las personas normales para el estudio de trasplante de células, o de hiPSCs de los pacientes con EP para el modelado in vitro de la EP o probar agentes terapéuticos potenciales para la EP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células madre pluripotentes humanos (incluyendo tanto hESCs y hiPSCs) pueden diferenciarse in vitro para generar la mayoría, si no todos, los tipos de células de nuestro cuerpo incluyendo las neuronas DA, que se ha demostrado en estudios previos 19. Aquí, basado en el conocimiento del desarrollo de neuronas dopaminérgicas embrionarias 20 y protocolos publicados de otros laboratorios 14,15, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la generación de neuronas DA de hES…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
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