İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminerjik (DA) nöronlar midbrain, hipotalamus, retina ve bulbuslarında dahil olmak üzere birçok beyin bölgelerinde bulunabilir. Ön beyinde striatum projelendirme ve ekstrapiramidal motor sistemini oluşturarak substantia nigra pars compacta (SNpc) kontrol davranış ve hareket A9 DA nöronlar. A9 DA nöronların dejenerasyonu ikinci en yaygın insan nörodejeneratif bir hastalıktır ve şu anda çaresiz Parkinson hastalığı (PH) yol açar. Hücre replasman tedavisi PH 1 tedavisi için en umut verici stratejilerinden biridir, bu nedenle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve hem de dahil olmak üzere, insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) den A9 DA nöronlar kaynaklanan büyük bir ilgi olmuştur Son insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs).
Pek çok araştırma, çeşitli yöntemler kullanarak hPSCs adlı A9 DA nöronları türetmek için çalıştı. Bir sinir yoluyla erken raporlar tüm oluşturulan DA nöronlarırozet ata sahne. Ile birlikte bir ya da 2-4 hafta, L. ve arkadaşları Studer'den ve başarılı bir şekilde sinir rozet üretmek için HESC uyarılan üç grup için dış büyüme faktörleri olmaksızın MS5 2 veya PA6 3-5 stromal hücreleri ile ortak-kültür. Daha sonra mekanik diseksiyon ya da daha fazla farklılaşması için enzimatik sindirim yoluyla bu rozetler zenginleştirilmiş. Diğer raporlarda, araştırmacılar kültür farklılaşmasını 6-9 yüzen embriyoit vücuda sinir rozetler (EB) oluşturulur. Daha sonra, araştırmacılar, ekstra hücresel matriks üzerinde HESC ve hiPSCs kaplama bir tek tabakalı göre ayırt etme yöntemini 10,11, in vivo oluşturulan embriyonik gelişme DA nöron taklit DA nöronlara hPSCs farklılaşmasını indüklemede kültür içinde değişik büyüme faktörleri ilave . Bütün bu çalışmalar, DA nöronlarının bazı özelliklere sahip tirosin hidroksilaz (TH) -expressing hücreleri elde edilmiş olmakla birlikte, bütün farklılaşma süreci, zaman ve iş gücü tüketengenellikle verimsiz ve daha da önemlisi, bu nöronların A9 kimlik LMX1a ektopik ifade 12 ile biri dışında en çalışmalarda gösterilmiştir değildi. Son zamanlarda, yeni bir taban plakası (FP) tabanlı protokol daha sonra DA nöron potansiyeli ile FP öncüleri ilk farklılaşma erken dönemde sonik kirpi ve doğal Wnt sinyal yollarının aktivasyonu tarafından oluşturulan edildiği 13-16, geliştirilen ve oldu Bu FP hücreler daha fazla DA nöronlarının için belirlenmiştir. Bu protokol daha verimli olmasına rağmen, hala bazı sorunlar var; Örneğin, tüm süreç farklılaşma uzun (en az 35 gün) sürer ve bağımlı besleyici hücre 15, ya da EB veya A9 kimliği 14 görülmemiştir 16 bağlıdır.
Burada, in vivo embriyonik DA nöron gelişimi ve diğer araştırmacıların yayınlanan sonuçlarına bilgiye dayalı, biz eff için kültür koşullarını optimizeHESC ve hiPSCs hem DA nöronların icient üretimi. Biz ilk olarak küçük molekül CHIR99021 ve küçük moleküller SAG ve purmorphamine ile sinyalizasyon sonik kirpi ile kanonik Wnt sinyal aktivasyonu ile FP öncül hücreleri üretilir. Bu FP hücreler FOXA2, LMX1a, Corin, OTX2 ve Nestin ifade eder. Biz sonra vb BDNF, GDNF'nin içeren büyüme faktörleri ile DA nöronlarının bu FP hücreleri belirtildi. Bunlar kalbindin 17 için ise negatif GIRK2 pozitif olarak üretilen DA nöronları hücre A9 tiptedir. Bu protokol, yüksek verimli ve yeniden üretilebilir bir besleyici hücre veya EB bağımsız vardır. Bu protokolü kullanarak, bir, ya da in vitro PH modelleme veya PH için potansiyel terapötik ajanların test için PD hastalarının hiPSCs gelen HESC veya hücre nakli çalışma için normal insanların hiPSCs daha az 4 hafta DA nöronları elde edebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
(HESC ve hiPSCs her ikisi de dahil olmak üzere), insan kök hücreleri en oluşturmak için in vitro olarak ayırt edilebilir, hepsi değilse de, daha önceki çalışmalarda 19'da gösterilmiştir DA nöronlarının da dahil olmak üzere vücut, hücre türleri. Burada, diğer laboratuarlar 14,15 embriyonik dopaminerjik nöron gelişiminde 20 den bilgi ve yayınlanmış protokollere dayalı, biz hESC ve hiPSCs DA nöronların nesil için kültür koşullarını optimize. B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
