Regissert dopaminerge Neuron Differensiering fra Menneskelig Pluripotent stamceller
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminerge (DA) nevroner kan bli funnet i flere områder av hjernen, inkludert midthjernen, hypothalamus, netthinnen, og olfactory pærer. A9 DA nevroner i substantia nigra pars comp (SNpc) kontroll atferd og bevegelse ved å projisere til striatum i brain og danner ekstrapyramidale motoriske system. Degenerasjon av A9 DA nevroner fører til Parkinsons sykdom (PD), som er den nest vanligste menneskelige nevrodegenerativ lidelse og for tiden uhelbredelig. Cell erstatningsterapi er en av de mest lovende strategi for behandling av PD-1, og derfor har det vært stor interesse for å utlede A9 DA nevroner fra humane pluripotente stamceller (hPSCs), inkludert både humane embryonale stamceller (hESCs) og den siste menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs).
Mye forskning har forsøkt å utlede A9 DA nevroner fra hPSCs ved hjelp av ulike metoder. De tidligste rapportene alle genererte DA nevroner gjennom en neuralrosett stamfar scenen. Ved co-dyrking med MS5 2 eller PA6 3-5 stromale celler med eller uten eksterne vekstfaktorer for 2-4 uker, L. Studer og kolleger og tre andre grupper vellykket indusert hESCs å produsere nevrale rosetter. De deretter beriket disse rosetter ved mekanisk disseksjon eller enzymatisk fordøyelse for ytterligere differensiering. I andre rapporter, genererte forskere nevrale rosetter gjennom embryoid kroppen (EB) flytende kultur differensiering 6-9. Senere etablerte forskere en monolayer basert differensiering metode 10,11, hvor de belagt hESCs og hiPSCs på ekstracellulære matrise, lagt ulike vekstfaktorer i kulturen å indusere differensiering av hPSCs til DA nevroner, som etterligner in vivo embryonale DA neuron utvikling . Selv om alle disse studiene erholdt tyrosin hydroksylase (TH) -expressing celler med noen karakteristikker av DA nevroner, er hele differensieringsprosessen tid og arbeidskrevende,generelt ineffektiv, og enda viktigere, A9 identiteten til disse nevronene ble ikke påvist i de fleste studier bortsett fra den ene med LMX1a ektopisk uttrykk 12. Nylig ble en ny gulvplate (FP)-basert protokoll utviklet 13-16, hvor FP-forløpere med DA neuron potensial ble først generert ved aktivering av den soniske hedgehog og kanoniske Wnt signalveier under de tidlige trinn av differensiering og deretter disse FP celler ble ytterligere spesifisert til DA nevroner. Selv om denne protokollen er mer effektiv, er det fortsatt noen problemer; For eksempel tar det hele differensieringsprosessen lang tid (minst 35 dager) og i matecelleavhengig 15, eller er avhengig av EB 16 eller A9 identitet ble ikke påvist 14.
Her, basert på kunnskap fra in vivo embryonale DA neuron utvikling og andre forskeres publiserte resultater, har vi optimalisert forholdene kultur for efficient generasjon av DA nevroner fra begge hESCs og hiPSCs. Vi først generert FP forløper celler ved aktivering av den kanoniske Wnt signal med lite molekyl CHIR99021 og sonisk pinnsvin signaliserer med små molekyler SAG og purmorphamine. Disse FP celler uttrykker FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 og NESTIN. Vi deretter spesifisert disse FP cellene til DA nevroner med vekstfaktorer inkludert BDNF, GDNF, etc. De genererte DA nevroner er av A9 celletype som de er positive for GIRK2 mens negativ for Calbindin 17. Denne protokollen er mater celle eller EB uavhengig, svært effektiv og reproduserbar. Ved hjelp av denne protokollen, kan man utlede DA nevroner i mindre enn 4 uker fra hESCs eller hiPSCs av normale personer for celletransplantasjon studie, eller fra hiPSCs av PD pasienter for in vitro modellering av PD eller testing potensielle terapeutiske midler for PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humant pluripotent stamceller (inkludert både hESCs og hiPSCs) kan differensieres in vitro for å generere de fleste, om ikke alle, celletyper i kroppen vår inkludert DA nevroner, noe som er vist i tidligere studier 19. Her, basert på kunnskap fra embryonale dopaminerge nevroner utvikling 20 og publiserte protokoller fra andre laboratorier 14,15, vi optimalisert forholdene kultur for generering av DA nevroner fra hESCs og hiPSCs. Denne protokollen er effektiv, reproduserbar o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
