Summary
Latexagglutination testning är en enkel, snabb och billig metod för serotypning Streptococcus pneumoniae, och har också i stor utsträckning i diagnostisk mikrobiologi. Detta manuskript beskriver intern produktion av latexagglutination reagenser, rutiner för kvalitetskontroll och tillämpningen av denna teknik för att pneumokocker serotypning.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet hos barn under fem år i hela världen, särskilt i resurssvaga miljöer 1,2. Intervall pneumokocksjukdom från lokala infektioner till livshotande tillstånd som lunginflammation, blodförgiftning och hjärnhinneinflammation 1,2.
Mer än 90 serotyper av pneumokocker har identifierats utifrån skillnader i deras kapselpolysackarid 3. Aktuella vacciner rikta kapselpolysackariden och ge skydd mot de stora serotyper som orsakar invasiv sjukdom 4. Serotypning pneumokocker isolat är viktig för att bedöma effekterna av vaccination på vagnen och sjukdom samt att ge mer omfattande epidemiologiska uppgifter 5,6. Den nuvarande "gyllene standarden" metod för pneumokocker serotypning är Quellung testet, men det är tidskrävande och kräver en del skicklighet för att perform 7. Latexagglutination är en alternativ serotypning metod som rekommenderas av Världshälsoorganisationen 7. Latexagglutination är snabb och enkel att utföra, och används i många laboratorier världen över 8-11. Viktigt har latexagglutination visat jämförbar noggrannhet till Quellung testet för pneumokocker serotypning 10,12-14. Totalt sett är denna metod idealisk för resurssvaga miljöer samt hög genomströmning laboratorier.
Latexagglutination reagenser ('latex reagens ") skapas genom att fästa antikroppar till latexpartiklar 15. I en positiv reaktion, dessa märkta partiklar agglutinerar i närvaro av specifikt antigen. Kommersiella latexreagens är tillgängliga för ett begränsat sortiment av serotyper. Latex reagens kan också beredas internt med hjälp av kommersiellt tillgängliga antisera 10. Blandningar av antiserum ("pooler") samt specifika antisera för pneumokock-serogroups (t.ex. grupp 19), enskilda serotyper (t.ex. serotyp 5), och till specifika antigener ("faktorer", till exempel., faktor 19c erkänner serotyp 19A) för ytterligare definiera serotyper inom grupper är tillgängliga 16.
Detta manuskript beskriver de viktigaste stegen i produktionen av latexreagens som använder passiv fastsättning av kommersiellt tillgängliga antisera till latexpartiklar. De kvalitetskontroll (QC) aspekter av denna metod beskrivs, och ett protokoll för användning av latexreagens för pneumokocker serotypning ingår.
Protocol
1 Beredning av egna Latex Reagens
- Framställning av glycin-buffrad saltlösning (GBS)
- Lägg 1,5 g glycin, 11,7 g natriumklorid och 100 ml destillerat vatten till en 200 ml glasbägare.
- Blanda att lösa med hjälp av en magnetisk omrörare.
- Överför blandningen till en 500 ml mätcylinder och tillsätt destillerat vatten till totalt 200 ml.
- Överför lösningen tillbaka till 200 ml bägare, kontrollera pH och justera till 8,2 med 5 M natriumhydroxid. OBS: Natriumhydroxid är frätande, använd personlig skyddsutrustning.
- Filtrera sterilisera lösningen med användning av 0,22 | iM filter och flera 60 ml sprutor i en 250 ml preautoclaved skruv capped glasflaska.
- Förvara vid RT.
- Framställning av GBS med 0,2% bovint serumalbumin
- Lägg 0,2 g bovint serumalbumin (BSA) pulver och 100 ml GBS till en 200 ml glasbägare och blanda för att lösa upp med hjälp av en magnetomrörare.
- FiltreraSterilisera lösningen genom 0,22 | iM filter med användning av flera 60 ml sprutor i en 250 ml preautoclaved skruv capped glasflaska.
- Förvara vid 4 ° C.
- Latex reagensberedning
- Märk en 2 ml rund mikrofugrör.
OBS: rund botten rör används för att minimera partikelsedimentering som kan påverka antikropps fastsättning. - Med hjälp av en P1000 pipett med sterila spetsar lägga 975 l av GBS i mikrofugrör, lägg sedan till 25 l av lämplig pneumokock antiserum för latexreagens förbereds (dvs pool, grupp, typ eller faktor). Vänd fem gånger för att blanda.
- Späd polystyrenlatexpartiklar 1:10 genom att tillsätta 120 l av latexpartiklar till 1080 l av steril fysiologisk saltlösning.
OBS: Detta kan göras i större volymer, men bör göras på nytt varje gång latexreagens produceras. - Lägg 1000 ul av 1:10 latexsuspension (framställd i steg 1.3.3) till ett,000 l 01:40 antiserum suspension (framställd i steg 1.3.2). Vänd fem gånger för att blanda.
- Inkubera vid 37 ° C på en långsamt roterande hjul (t.ex. 4 rpm under ett hjul på 38,5 cm i diameter) för 2 tim.
- Centrifugera i 15 minuter vid 1100 x g. Kasta bort supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 2 ml steril saltlösning.
- Centrifugera i 15 minuter vid 1100 x g. Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml GBS och försiktigt suspendera pelleten.
- Pipet latexsuspensionen i ett märkt 5 ml med skruvlock rör. Lägg ytterligare 1 ml GBS.
- Tillsätt 2 ml av GBS innehållande 0,2% BSA (vikt / volym) (pH 8,2) (framställd i steg 1,2). Lägg 40 | il av 10% (vikt / volym) lösning av natriumazid som konserveringsmedel.
OBS! Natriumazid är farligt vid inandning och är en hud och ögonirriterande. Det är önskvärt att köpa en förberedd 10% lösning i stället för pulverform, eftersom det minimerar risken för inandning. Personlig skyddsutrustning (inklusive handskar end skyddsglasögon) ska användas vid hantering av detta reagens. Läs i Säkerhetsdatablad för detaljer. - Affär latexreagens vid 4 ° C.
- Märk en 2 ml rund mikrofugrör.
- Framställning av negativ kontroll latexreagens
- Märk en 2 ml rund mikrofugrör.
OBS: rund botten rör används för att minimera partikelsedimentering som kan påverka antikropps fastsättning. - Med hjälp av en P1000 pipett med sterila spetsar lägga 975 l av GBS i mikrofugrör, lägg sedan till 25 ^ normalt kaninantiserum. Vänd fem gånger för att blanda.
- Fortsätt som i steg 1.3.3 till 1.3.10 ovan
- Märk en 2 ml rund mikrofugrör.
2 Kvalitetskontroll (QC) i Latex Reagens
- Bring latexreagenset till RT. Omedelbart före användning, blanda försiktigt latexreagenset genom att vända röret flera gånger.
- Kontrollera reagens för autoagglutination genom pipettering 15 ul på en glasobjektglas och fortsätt som i steg 4.7 och 4.8 nedan. Det bör inte vara engglutination av latexpartiklarna. Reagenset ska visas vit och slät.
- Testa reagens mot en panel av låg passage pneumokock isolat. Använd färska odlade kulturer framställda som i steg 3 Panelen av isolaten bör omfatta isolat av "target" serotyp (den specifika serotyp för reagens som testas) och "icke-mål" serotyper (isolat av andra serotyper som inte normalt korsar reagera med reagenset). Inkludera minst ett isolat av varje mål och icke-mål serotyp för varje latexreagens genomgår QC. Om det finns bara ett mål eller inte mål serotyp, testa två olika isolat av särskilt serotyp.
OBS: Testpanelen bör innehålla flera isolat av varje serotyp, av vilka några är ovanliga i invasiv sjukdom och / eller typ kultursamlingar. Det är bättre att inkludera några vagnen isolat, eftersom de ofta är mer krävande för serotyp (data visas ej), vilket ytterligare testa kapaciteten of reagenserna och se till att reagenserna sannolikt kan serotypning både invasiv och vagn isolat. - Fortsätt med provning av latexreagens med mål och icke-mål pneumokocker isolat enligt den metod som beskrivs i steg 3 och 4 nedan.
- Kvalitetskontroll reagenser vid tidpunkten för produktionen och därefter minst årligen därefter.
OBS: Om ett reagens inte klarar QC, måste partiet kasseras och ett nytt preparat görs. I händelse av upprepad QC misslyckande rekommenderar vi reagensen produceras med användning av de alternativa metoder som beskrivs i Ortika et al. 2013 8 och i diskussionen nedan.
3 Beredning av pneumokocker kulturer för Serotypning
- Med hjälp av en steril ögla välja en enda koloni av pneumokock isolera och strimma detta ut på en fast icke-selektivt blodagar så att det primära inokulatet täcker ungefär en tredjedel av plattans yta. Serie för enstaka kolonier.
OBS: Plattor framställda från defibrinerat häst eller fårblod är lämpliga; men blodplattor framställda med blod eller citratbehandlat djurblod inte. - Inkubera plattan O / N vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2.
- Observera tillväxten på plattan för renhet och bedömer att det finns tillräcklig tillväxt för serotypning.
OBS: En ren kultur av pneumokocker isolat krävs för serotypning. Enligt vår erfarenhet, konfluent eller nära konfluent tillväxt som täcker ungefär en tredjedel av plattans yta är vanligen tillräcklig för att fullborda serotypning. Som pneumokocker kulturer kan vara benägna att autolys bör kulturerna förberedda för serotypning testas inom 24 h av subkultur. Ta inte odlingsplattan ur kuvösen mer än 15 till 20 minuter innan serotypning påbörjas.
4. Utförandet latexagglutination Serotypning
- Ta bort alla latexreagens från kylskåpet och låt dem värmas till RT i caimately 30 min. Omedelbart före användning, vänd försiktigt rören för att blanda reagenserna.
- Märk ett objektglas.
- Placera 15 l av negativt kontrolllatexreagens på objektglas.
- Med hjälp av en steril engångs 1 il slinga ta ett svep av pneumokock kultur så att öglan är ungefär halvfull.
- Smeta försiktigt inokulum på ytan av sliden nära den droppe negativ kontroll latexreagens. Inokulatet bör synas på glasskiva.
- Snabbt och grundligt blanda inokulat i den negativa kontrolllatexreagens använder slingan. Se till att nedgången går sprids inte vidare än den ursprungliga storleken.
- Plocka upp bilden, hålla den i båda ändar. Rock bilden fram och tillbaka i 1 min. Se till att hålla vätskan rör sig långsamt, och se till att storleken på nedgången inte ökar.
OBS: Du kan använda en tallrik rocker. - Observera för makroskopisk agglutination (dvs genomblotta ögat) och clearing av suspensionen mot en svart bakgrund.
- Om den negativa kontrollen latexreagens visar ingen agglutination eller clearing fortsätter testa kulturen, som ersätter provlatexreagens för den negativa kontrollen latexreagens i steg 4,1-4,8 ovan. En ny slinga måste användas varje gång. Fortsätt med testning av latexreagens som börjar med poolerna.
- Testa varje Bassäng "latexreagens i följd tills ett positivt test erhålls.
OBS. Ordningen testning av pooler kan göras i "rundor" för att återspegla den lokala förekomsten av vissa serotyper (t.ex. genom att testa för de tre mest sann pooler på den första bilden Om en positiv reaktion inte erhålls, då testet nästa tre mest sannolika av de återstående pooler på den andra sliden, och så vidare tills en positiv reaktion erhålles). Detta säkerställer att de mest vanliga serotyperna Först testas, vilket minimerar den tid och reagens behövs. - Använda antisera tillverkarens nyckel avgöra vilka individuella antisera är representerade i den positiva poolen.
- Testa varje grupp eller typer som ingår i den positiva poolen för sig att bestämma "grupp" eller "typ" som i steg 4,1-4,8 ovan.
- Bestäm resultatet med hänvisning till antisera tillverkarens nyckel. Om en "typ" bestäms (t.ex. serotyp 5), då behövs ingen ytterligare provning och detta resultat registreras.
- Om en "grupp" bestäms (t.ex. grupp 19), se sedan till tillverkare nyckeln för att avgöra vilka faktorer som ska testas. Fortsätt att testa med de enskilda "faktor" latexreagens och bestämma den slutliga serotyp (t.ex. serotyp 19B).
Representative Results
En positiv latex reaktion sker när typ-specifik antikropp kopplad till latexpartikel binder till kapseln av pneumokocker, och agglutination av antikroppsmärkta partiklar följer 15. Figur 1A visar en positiv reaktion som kännetecknas av agglutination och clearing av bakgrunden suspension. En negativ reaktion kännetecknas av latexagglutination reagens fjädring återstående slät och vit (Figur 1B). Reagensen är optimerade så att en positiv reaktion bör observeras före slutet av den en min tidsintervall (vanligtvis detekterbar i ungefär 20 sek). Vi rekommenderar inte att läsa reaktioner efter den 1 min tidsintervall. Någon enstaka gång, reaktioner visar svag agglutination runt kanten på droppen som inte åtföljs av clearing av bakgrunds fjädring, eller verkar "trådiga" utan bakgrund clearing (data visas ej). Dessa är mest lik ly negativa reaktioner. I sådana fall rekommenderar vi omprov och / eller ytterligare undersökning med en annan serotypning metod (t.ex. Quellung reaktionen 17).
Figur 1. Positiva och negativa latex agglutinationsreaktioner. Beredningar av pneumokocker isolat blandat med latexagglutination reagens som visar en positiv reaktion (A) eller en negativ reaktion (B). Agglutination tillsammans med clearing av bakgrunden ses i positiv reaktion (A) .Det finns ingen synlig agglutination med den negativa kontrollen latexreagens eller i ett negativt test reaktion (B). Fotografier 8 används med tillstånd."Target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Latex agglutinationen är en enkel, snabb och billig metod för pneumococcal serotypning. Kommersiella pneumokock latexagglutination reagenser finns, men de för närvarande inte skilja alla kända serotyper av pneumokocker 10,12. Däremot kan latexagglutination reagenser lätt produceras i egen regi med hjälp köpt antisera mot specifika pneumokocker kapselantigener. I den här beskrivna metoden, är antikroppar passivt fäst vid latexpartiklar för att göra en uppsättning av latexagglutination reagens.
En positiv latex reaktion sker när specifika antikroppar bundna till latexpartiklarna fäster antigener på polysackaridkapsel av pneumokocker isolera 18,19. De latexpartiklar bundna till antikropparna tillåta specifik antikropp-antigenreaktion som skall visualiseras utan förstoring.
Latexagglutination är en lämplig metod för hög genomströmning laboratorier ettd även för resurssvaga miljöer. Viktiga fördelar med latexagglutination metoden är att ingen specialutrustning som krävs för att utföra provet, reagens har en hållbarhet på minst 2 år vid förvaring vid 4 ° C 8, och att det är billigt, enkelt och snabbt att utföra. Serotypning ett pneumokock isolat från latexagglutination tar ca 10 min och upp till fyra latexreagens kan testas parallellt på en bild. Dessutom, om prevalensen av serotyper är känd för den aktuella epidemiologiska inställning, testning kan utföras i omgångar börjar med poolerna innehåller de vanligaste serotyperna i likhet med Quellung testet 17. Detta tillvägagångssätt minimerar antalet tester som behövs för att bestämma serotyp. Metoden är också mycket reproducerbar mellan olika operatörer (data ej visade). En nackdel med latexagglutinering serotypning är att framställa reagensen är tidskrävande, tar ca 4 h; även om multipla Reagents kan lätt framställas parallellt. Dessutom kan vissa antigener är vanliga i olika pneumokockserotyper, vilket resulterar i korsreaktioner med vissa antisera (t.ex. serotyp 29, 42 och grupp 35). Men dessa korsreaktioner väl karakteriserade vid användning av kommersiella antisera (som vanligtvis är förabsorberats att ta bort de mer problematiska korsreagerande antikroppar) och ytterligare reaktions tabeller som tillhandahålls av tillverkaren för att särskilja vilken serotyp är närvarande. Latex reagens kan också korsar reagera om antikropparna inte är ordentligt justerade på latexpartiklarna; dessa detekteras som QC misslyckanden. Enligt vår erfarenhet är rigorös QC central för att lyckas med denna metod, även om kommersiellt tillgängliga antisera används för produktion. QC tar ca 15 min per reagens och förlitar sig på en uppsättning lämpliga QC isolat som beskrivs ovan.
Den metod som beskrivs här resulterar i reagenser som ger en positiv reaktion väl witunna testperioden. Enligt vår erfarenhet, falska positiva är sällsynta i praktiken (data ej visade). Enstaka falskt negativa reaktioner iakttas; oftast dessa hänför sig till kända problem med en viss antiserum (t.ex. kan serogrupp 6 isolat inte reagerar med pool B antiserum) eller nedreglering av kapseluttryck av isolat. Använda serotypning algrorithm från tillverkaren är också viktigt, som i de flesta fall en falsk positiv eller negativ reaktion kommer att leda till en "blinda änden" resultat. I dessa fall, och när reaktioner är svåra att tolka, rekommenderar vi upprepa-testning och / eller testning av en alternativ metod, såsom den Quellung reaktionen.
Viss felsökning ibland krävs för att göra tillfredsställande latexreagens. I den här beskrivna metoden är antikroppen bunden till latexpartiklar via passiv adsorption 15,19, så en kritisk variabel är koncentrationen av antikropp som används, vilket avgör hur välytan av latexpartiklarna är täckt och den efterföljande inriktning av de antikropps aktiva ställen 15,20. Om följaktligen otillräcklig eller överskott av antikropp är bunden till latexpartiklarna, de antikropp-antigen-reaktioner kommer inte att vara optimal, och otillfredsställande reagens kan framställas 15,20,21. Som antikroppstitrar varierar mellan olika massor av antisera kan en standarduppsättning av späd producerar inte reagenser som ligger långt 8. En bra utgångspunkt är att använda en 1:40 spädning av antiserum, och om detta inte lyckas, späd antiserum ytterligare. Enligt vår erfarenhet är detta löser oftast problemet 8. I ett litet antal fall reagens kan visa svag agglutination som inte åtföljs av clearing av suspensionen vid test med målet isolat. I dessa fall utspädning av antiserum inte förbättra kvaliteten på reagenset, men tillfredsställande reagens kan vanligen framställas genom att utelämna centrifugering och tvättsteg 8,22
Antikroppsbelagda latexpartiklar används vanligen inom mikrobiologisk diagnostik för detektion, identifiering eller serotypning av många olika mikrober 15,20. Som sådan kan den här beskrivna metoden vara lämplig för framställning av latexreagens för andra ändamål, tillhandahålls lämplig antisera tillgängliga och lämpliga kvalitetskontrollförfaranden antas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to RT before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to RT before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to rRT before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to RT before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | ||
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials |
References
- Rudan, I., et al. Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries. J Glob Health. 3 (10401), (2013).
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
- Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).
- Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
- Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. , (2013).
- Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping. BMC Res Notes. 6 (49), (2013).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).
- Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex). J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).
- Turner, P., et al. Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray. J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).
- Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae. J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).
- Lalitha, M. K., et al. Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries. Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).
- Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).
- Gella, F., Serra, J., Gener, J.
- Pneumococcus Key to S. pneumoniae types and pneumococcal diagnostic antisera. SSI Diagnostica. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
- Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction. J. Vis. Exp. (84), (2014).
- Arai, S., et al. Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae. Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).
- Lafong, A. C., Crothers, E. Simple latex agglutination method for typing pneumococci. J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).
- Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests. J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).
- Yap, K. L. Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection. Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).
- Severin, W. P. Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis. J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).
