Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
التصاق خلية خلية هو الأساسي في الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من بروتينات سطح الخلية. ومع ذلك، يتم مفهومة التفاعلات لاصقة لكثير من هذه البروتينات. هنا نقدم طريقة بسيطة وسريعة لوصف خصائص لاصقة من المفترضة مقتصر على المطابق جزيئات التصاق الخلية. و transfected خلايا HEK293 مثقف مع بلازميد الحمض النووي ترميز يفرز،، حاتمة الموسومة ectodomain من بروتين سطح الخلية. باستخدام الخرز بين functionalized محددة للعلامة حاتمة، يتم التقاط القابلة للذوبان، انصهار بروتين يفرز من مستنبت. ويمكن بعد ذلك حبات المغلفة استخدامها مباشرة في حبة المقايسات التجميع أو في حبة الفلورسنت فرز فحوصات لاختبار التصاق مقتصر على المطابق. إذا رغبت، الطفرات يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتوضيح الأحماض الأمينية المحددة أو المجالات المطلوبة للالتصاق. هذا الاختبار يتطلب سوى كميات صغيرة من البروتين المعبر عنها، لا يتطلب إنتاج خطوط الخلايا مستقرة، ويمكن عكاmplished في 4 أيام.
التصاق خلية خلية ضروري لتطوير وسلامة الكائنات متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من جزيئات سطح الخلية. وقد تم تحديد العديد من هذه جزيئات الالتصاق ويتميز، رغم أن الكثيرين لا يزال يتعين اكتشافها. وتستخدم عدة طرق لتحقيق خصائص خلية التصاق جزيئات (الحدب)، بما في ذلك الخلايا فرز فحوصات، فحوصات تجميع خلية 1-8 والأساليب الفيزيائية الحيوية، مثل مجهر القوة الذرية والسطحية قوة التحليل الطيفي 9-12.
تعقيد حتى مبسطة في أنظمة المختبر باستخدام خطوط الخلايا يجعل من الصعب تحديد خصائص لاصقة من المفترض CAM. عادة، يعتبر جزيء وCAM إذا كان يدفع تجميع الخلايا عندما transfected في خط خلية غير لاصقة. ومع ذلك، فمن الواضح أن هذا ليس دليل مباشر على النشاط اصقة. على سبيل المثال، وتسهيل إيصال سطح الخلية أو استقرارسوف CAM يؤدي أيضا إلى زيادة تجميع خلية 1،13. وعلاوة على ذلك، قد تفشل CAM صحيح للتوسط تجميع خلية إذا كان خط الخلية تفتقر العوامل المشتركة الأخرى المطلوبة للتسليم سطح الخلية أو الاستقرار.
لتجنب هذه العوامل المعقدة، والمزيد من المقايسات المباشرة يمكن استخدامها التي تستند على فكرة أن التفاعلات لاصقة يجب أن تكون خاصية البيوكيميائية الجوهرية المجال خارج الخلية. بينما الخرز المستخدمة في البداية لوصف NG-CAM 2، وقد تم تمديد هذه المقايسات من أجل التحقيق بوساطة كادهيرين التصاق 12،14،15. باستخدام الانصهار من C-كادهيرين اندماج ectodomain-FC، أظهر مختبر Gumbiner أن يكرر كادهيرين متعددة تساهم في التفاعلات مقتصر على المطابق 14. عن طريق مقارنة المقايسات حبة التجميع، E-كادهيرين وN-كادهيرين التصاق كما تم يتميز 12،15، وكذلك عدد من protocadherins 1،15-18 والإسوية Dscam من ذبابة الفاكهة <em> 19. نحن هنا وصف مقايسة بسيطة نسبيا وسريع لوصف النشاط لاصقة من يفرز، ectodomains الموسومة حاتمة من الحدب مقتصر على المطابق المفترضة (الشكل 1). وقد استخدمنا هذا الاختبار في المقام الأول إلى تميز أعضاء الفصيلة كادهيرين.
التصاق الخلية هو سمة أساسية من سمات الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة واسعة من بروتينات سطح الخلية. من هذه، وفهم الخصائص التفصيلية لاصقة سوى نسبة صغيرة نسبيا. هنا، التي وصفناها بروتوكول بسيطة وسريعة للتحقيق في قدرة لاصقة مقتصر على المطابق من ectodomains يفرز تنصهر علا…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
Table of Buffers/Solutions | ||
Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |