Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d'adhésion cellulaire putatif
Summary
Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Abstract
L'adhérence cellule-cellule est essentielle à la vie multicellulaire et est médiée par une grande diversité de protéines de la surface cellulaire. Cependant, les interactions adhésives pour un grand nombre de ces protéines sont mal compris. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives des homophiles des molécules d'adhésion cellulaire putatifs. De culture des cellules HEK293 sont transfectées avec l'ADN plasmidique codant pour une sécrétion, un ectodomaine d'une étiquette d'épitope d'une protéine de surface cellulaire. Utilisation de billes fonctionnalisées spécifiques pour le marqueur d'epitope, le soluble, la protéine de fusion sécrétée est capturé à partir du milieu de culture. Les billes enrobées peuvent alors être utilisés directement dans des tests d'agrégation billes ou à bille fluorescente tri dosages pour tester l'adhérence homophile. Si on le souhaite, la mutagenèse peut être utilisée pour élucider les acides aminés ou domaines spécifiques nécessaires pour l'adhérence. Ce dosage ne nécessite que de petites quantités de protéine exprimée, ne nécessite pas la production de lignées cellulaires stables, et peut être accomplished à 4 jours.
Introduction
L'adhérence cellule-cellule est essentielle pour le développement et l'intégrité des organismes multicellulaires et est médiée par une grande diversité de molécules de la surface cellulaire. Beaucoup de ces molécules d'adhésion ont été identifiés et caractérisés, mais beaucoup restent à découvrir. Plusieurs méthodes sont utilisées pour étudier les propriétés des molécules d'adhésion cellulaire (CAM), y compris le tri cellulaires essais, des tests d'agrégation de cellules 1-8 et méthodes biophysiques, comme la microscopie à force atomique et la surface spectroscopie de force 9-12.
La complexité de la même simplifié dans des systèmes in vitro utilisant des lignées cellulaires, il est difficile de déterminer les propriétés adhésives d'une CAM putatif. Typiquement, une molécule est considérée comme une CAM si elle induit une agrégation cellulaire lorsqu'il est transfecté dans une lignée cellulaire non-adhésif. Toutefois, il est clair qu'il ne s'agit pas de preuve directe de l'activité de l'adhésif. Par exemple, faciliter la distribution de surface de la cellule ou de la stabilité d'unCAM se traduirait également par l'agrégation cellulaire accrue 1,13. De plus, un vrai CAM peut échouer la médiation agrégation cellulaire si la lignée cellulaire n'a pas d'autres co-facteurs nécessaires pour la livraison de la surface cellulaire ou de stabilisation.
Pour éviter ces facteurs de risque, des tests plus directs peuvent être employées qui sont fondées sur l'idée que les interactions adhésives doivent être une propriété intrinsèque biochimique du domaine extracellulaire. Alors que les perles étaient initialement utilisés pour caractériser Ng-CAM 2, ces essais ont été étendus afin d'enquêter sur la cadhérine-médiation adhérence 12,14,15. Utilisation de fusion des fusions C-cadhérine ectodomaine-Fc, le laboratoire a montré que Gumbiner multiples répétitions de cadhérine contribuent à des interactions homophiles 14. En utilisant des tests d'agrégation de perles comparables, la E-cadhérine et la N-cadhérine adhésion ont également été caractérisé 12,15, comme l'ont fait un certain nombre de PROTOCADHERINES 1,15-18 et isoformes DSCAM de Drosophila <em> 19. Nous décrivons ici un test relativement simple et rapide pour la caractérisation de l'activité adhésive de sécrétées, ectodomaines de marquage épitopique de cames de homophiles putatifs (figure 1). Nous avons utilisé ce test essentiellement de caractériser les membres de la superfamille des cadhérines.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'adhésion cellulaire est un élément essentiel de la vie multicellulaire et est médiée par une large gamme de protéines de la surface cellulaire. Parmi ceux-ci, les propriétés adhésives détaillées sont comprises que pour une part relativement faible. Ici, nous avons décrit un protocole simple et rapide pour enquêter sur la capacité adhésive homophile de ectodomaines sécrétées fusionnées à une étiquette d'épitope pratique. Cette approche a un certain nombre d'avantages importants. Premi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
| pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
| HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
| DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
| 100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
| Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
| Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
| Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
| Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
| 0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
| Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
| Table of Buffers/Solutions | ||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |
References
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