Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen
Summary
Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Abstract
Cel-cel adhesie is fundamenteel voor meercellig leven en wordt gemedieerd door een divers scala aan eiwitten van het celoppervlak. Echter, de bindingsinteracties voor veel van deze eiwitten slecht begrepen. Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de klevende eigenschappen van vermeende homofiele celadhesiemoleculen. Gekweekte HEK293 cellen getransfecteerd met DNA dat codeert voor een uitgescheiden, epitoop-gelabelde ectodomein van een celoppervlakte-eiwit. Met gefunctionaliseerde kralen specifiek voor het epitoop tag, wordt de oplosbare, uitgescheiden fusie-eiwit gevangen uit het kweekmedium. De beklede korrels kunnen vervolgens direct in kraal aggregatie assays of fluorescente kralen sortering assays om te testen op homofiele adhesie. Desgewenst kan mutagenese dan worden gebruikt om de specifieke aminozuren of domeinen die voor hechting helderen. Deze test vereist slechts kleine hoeveelheden van tot expressie gebracht eiwit, niet vereist de productie van stabiele cellijnen en kan worden ACCOmplished in 4 dagen.
Introduction
Adhesie van cellen is essentieel voor de ontwikkeling en integriteit van meercellige organismen en wordt gemedieerd door een diverse reeks van celoppervlakmoleculen. Veel van deze adhesiemoleculen zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd, hoewel velen nog worden ontdekt. Verschillende methoden worden gebruikt om de eigenschappen van celadhesie moleculen (CAMs), inclusief celsortering assays, cel aggregatie assays 1-8 en biofysische werkwijzen zoals atomic force microscopie en oppervlaktekracht spectroscopie 9-12 onderzoeken.
De complexiteit zelfs vereenvoudigde in vitro systemen die cellijnen bemoeilijkt de kleefeigenschappen van een vermeende CAM bepalen. Typisch wordt een molecuul als een CAM indien induceert cel aggregatie bij getransfecteerd in een niet hechtende cellijn. Het is echter duidelijk dat dit niet direct bewijs kleefmiddel activiteit. Bijvoorbeeld, het celoppervlak levering of stabiliteit van een vergemakkelijkingCAM leidt ook tot verhoogde celaggregatie 1,13. Bovendien kan een echte CAM niet aan celaggregatie mediëren als de cellijn mist andere co-factoren nodig zijn voor celoppervlak levering of stabilisatie.
Om deze complicerende factoren te vermijden, meer direct testen kunnen worden gebruikt die zijn gebaseerd op het idee dat bindingsinteracties dient een intrinsieke biochemische eigenschap van het extracellulaire domein. Terwijl korrels aanvankelijk gebruikt Ng-CAM 2 karakteriseren, zijn deze assays uitgebreid om-cadherine-gemedieerde adhesie 12,14,15 onderzoeken. Met fusie van de C-cadherine ectodomein-Fc-fusies, de Gumbiner lab bleek dat meerdere cadherine herhalingen bijdragen tot 14 homofiele interacties. Met vergelijkbare kraal aggregatie assays, E-cadherine en N-cadherine hechting zijn ook gekarakteriseerd 12,15, evenals een aantal protocadherines 1,15-18 en Dscam isovormen van Drosophila <em> 19. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en snelle test voor het karakteriseren van de kleefstof activiteit van uitgescheiden, epitoop-gemerkte ectodomeinen van vermoedelijke homophilic CAMs (figuur 1). We hebben deze assay gebruikt hoofdzakelijk, leden van de cadherine-superfamilie karakteriseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celhechting een essentieel kenmerk van meercellig leven en wordt gemedieerd door een brede reeks celoppervlak eiwitten. Hiervan worden de gedetailleerde kleefeigenschappen begrepen slechts een relatief klein deel. Hier hebben we een eenvoudige, snelle protocol beschreven voor het onderzoeken van de homofiele hechtmiddel aantal uitgescheiden ectodomeinen gefuseerd aan een geschikte epitoop tag. Deze benadering heeft een aantal belangrijke voordelen. Eerst worden stabiele cellijnen niet nodig 14,20, voldoende h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
| pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
| HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
| DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
| 100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
| Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
| Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
| Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
| Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
| 0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
| Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
| Table of Buffers/Solutions | ||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
