Bead aggregeringsanalyser för karakterisering av Förmodade celladhesionsmolekyler
Summary
Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Abstract
Cell-cell adhesion är grundläggande för flercelliga livet och förmedlas av en mångfald av cellytproteiner. Emellertid är de adhesiva interaktioner för många av dessa proteiner dåligt kända. Här presenterar vi en enkel, snabb metod för att karakterisera de vidhäftande egenskaperna hos förmodade homofil cellvidhäftningsmolekyler. Odlade HEK293-celler transfekteras med DNA-plasmid som kodar för en utsöndrad, epitopmärkta ektodomänen av ett cellytprotein. Användning av funktionaliserade pärlor specifika för epitopmärkningen, är den lösliga, utsöndrade fusionsprotein fångat från odlingsmediet. De belagda kulorna kan sedan användas direkt i däckfots aggregeringsanalyser eller i fluorescerande pärla sortering analyser för att testa för homofil vidhäftning. Om så önskas kan mutagenes sedan användas för att belysa de specifika aminosyror eller domäner som krävs för vidhäftning. Denna analys kräver endast små mängder uttryckt protein, inte kräver att få se stabila cellinjer, och kan Accomplished i 4 dagar.
Introduction
Cell-cell adhesion är viktigt för utvecklingen och integritet flercelliga organismer och förmedlas av en mångfald av cellytemolekyler. Många av dessa adhesionsmolekyler har identifierats och karakteriserats, men många återstår att upptäcka. Flera metoder används för att undersöka egenskaperna hos celladhesionsmolekyler (CAMs), inklusive cellsorteringsanalyser, cell aggregeringsanalyser 1-8 och biofysiska metoder, såsom atomkraftsmikroskopi och ytan kraft spektroskopi 9-12.
Komplexiteten i ens klas in vitro-system med användning av cellinjer gör det svårt att bestämma de vidhäftande egenskaperna hos en förmodad CAM. Typiskt är en molekyl vara ett CAM om det inducerar cellaggregation när den transfekteras in i en icke-vidhäftande cellinje. Det är emellertid uppenbart att detta inte är direkta bevis för adhesiv aktivitet. Exempelvis underlättar leverans cellyta eller stabiliteten hos ettCAM skulle också leda till ökad cellaggregation 1,13. Dessutom kan en sann CAM misslyckas med att förmedla cellaggregation om cellinje saknar andra co-faktorer som behövs för leverans eller stabilisering cellytan.
För att undvika dessa komplicerande faktorer, mer direkta analyser kan användas som bygger på tanken att adhesiva interaktioner bör vara en inneboende biokemisk egenskap av den extracellulära domänen. Medan pärlor ursprungligen användes för att karakterisera Ng-CAM 2, har dessa analyser utökats för att undersöka cadherin-medierad vidhäftning 12,14,15. Genom att använda fusion av C-cadherin ektodomän-Fc fusioner visade Gumbiner labbet att flera cadherin upprepningar bidrar till homofil interaktioner 14. Med jämförbara vulst aggregeringsanalyser, E-cadherin och N-cadherin vidhäftnings har också karaktäriserats 12,15, som har ett antal protocadherins 1,15-18 och Dscam isoformer från Drosophila <em> 19. Här beskriver vi en relativt enkel och snabb analys för att karakterisera den adhesiva aktiviteten hos utsöndrade, epitopmärkta ektodomäner av förmodade homofil CAM (Figur 1). Vi har använt denna analys främst att karakterisera medlemmar i cadherin superfamiljen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celladhesion är ett väsentligt inslag i flercelliga livet och förmedlas av ett brett utbud av cellytproteiner. Av dessa är de detaljerade vidhäftningsegenskaper förstås endast en relativt liten del. Här har vi beskrivit en enkel, snabb protokoll för undersökning av homofil vidhäftning av utsöndrade ektodomäner fuserade till ett bekvämt epitopmarkör. Detta tillvägagångssätt har ett antal viktiga fördelar. Först är stabila cellinjer inte krävs 14,20, som tillräckliga mängder av proteinet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
| pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
| HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
| DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
| 100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
| Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
| Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
| Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
| Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
| 0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
| Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
| Table of Buffers/Solutions | ||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
