Snabb analys av kromosomavvikelser hos mus B lymfocyter från PNA-FISH
Summary
DNA-reparationsvägar är viktiga för upprätthållandet av genomisk integritet och förhindra mutation och cancer. Målet med detta protokoll är att kvantifiera genomisk instabilitet genom direkt observation av kromosomavvikelser i metafas sprids från mus B-celler med fluorescerande in situ hybridisering (FISH) för telomeric DNA upprepas.
Abstract
Defekt DNA-reparation leder till ökad genomisk instabilitet, vilket är den grundläggande orsaken till mutationer som leder till tumörbildning. Analys av frekvens och typ av kromosomavvikelser i olika celltyper gör att defekter i DNA-reparationsvägar som ska belysas. Förstå däggdjurs DNA-reparation biologi har stor hjälp av produktionen av möss med knockouts i specifika gener. Målet med detta protokoll är att kvantifiera genomisk instabilitet i mus B-lymfocyter. Märkning av telomererna använder PNA-FISH prober (peptidnukleinsyra – fluorescent in situ hybridisering) underlättar snabb analys av genomisk instabilitet i metafas kromosom uppslag. B-celler har specifika fördelar jämfört med fibroblaster, eftersom de har normal ploidi och ett högre mitotiska indexet. Korttids kultur av B-celler kan således exakt mätning av genomisk instabilitet i en primär cellpopulation som sannolikt kommer att ha färre sekundära genetisk mutations än vad som normalt återfinns i trans fibroblaster eller patient cellinjer.
Introduction
Cancer orsakas av en ansamling av mutationer som påverkar generna som reglerar normal celltillväxt. Mutation är en konsekvens av förändringar i strukturen och sekvensen av genomet orsakas av skador på DNA. DNA-skador kan uppstå genom olika processen, inklusive exogena medel såsom joniserande strålning, och som en biprodukt av normala cellulära metabolismen, såsom spontan deaminering av nukleotidbaser eller skador som inträffar genom kontakt med reaktiva syreradikaler 1.
Även däggdjursceller har en rad reparationsverksamhet som kan vända DNA-skada eller återställa sekvensen vid brytplatser, mutationer ändå ackumuleras under hela livslängden för en cell. DNA-skada kan dessutom bidra till åldrande och förlust av potens av stamceller, två processer som är förknippade med åldrandet-associerad sjukdom 2. Förstå reparation av DNA-skador är därför centralt att ta itu med två teckenificant frågor i folkhälsan. Ökande bevis antyder att däggdjurs-DNA-reparationsvägar kan bidra till utvecklingen av cancercellgenomet 3,4, vilket gör det ännu mer nödvändigt att förstå de inblandade vid undertryckande mutation vid den molekylära nivån processer.
Direkt visualisering av kromosomavvikelser är ett kraftfullt och kvantitativa medel för att fastställa omfattningen av genomisk instabilitet i en viss celltyp. Kondenserade kromosomer från celler vid metafas kan isoleras och kontrolleras med hjälp av ljus eller fluorescerande mikroskopi. Sådana cytogenetiska angreppssätt har varit i praktiken i flera decennier och kan användas för att visa förekomsten av transloka eller särskilda typer av kromosomavvikelser i samband med förlust av DNA-reparationsverksamhet. Protokollet lämpar sig till flera potentiella förlängningar: kromosomer kan märkas med prober för spektral karyotypning (SKY) eller multicolor fluorescent in situ hybridisering(MFISH) för att identifiera flyttningar 5,6. Dessa tekniker möjliggör också frekvensen av kromosomtransloka och strukturen av komplexa kromosomtransloka som skall fastställas, vilket ger ytterligare information utöver vad som är möjligt med detta protokoll. Alternativt kan alstras sekvensspecifika prober och användes för att testa frekvens av DNA sönder vid valda genomiska platser 7.
I detta protokoll, beskriver vi framställningen av metafaskromosom sprids från B-lymfocyter. Ett fluorescensmärkt peptid-nukleinsyra (PNA) sond för telomera upprepningar används, vilket effektivt markerar telomerer i metafaskromosom sprider Detta protokoll har flera fördelar. B-celler kan induceras till att växa vid högt mitotiskt index, så att högkvalitativa spread konsekvent kan produceras. B-celler från genetiskt modifierade möss är också mycket mindre att innehålla sekundära genetiska mutationer som kan förbrylla analysen av bidraget sannoliktav specifika gener till genomisk integritet. PNA-FISH tillvägagångssätt kan fyllas i på en dag, och tillåter mer exakt poängsättning av kromosombrott. Genom att använda denna metod, speciellt i kombination med särskild utrustning som beskrivs i detta protokoll, är det möjligt att producera mycket konsekventa, högkvalitativa uppslag och snabbt analysera hastighet och typ av genomisk instabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skäl aktiverade B-lymfocyter är särskilt lämpade för framställning av mitotiska kromosom uppslag, kan andra celltyper även användas. T-lymfocyter delar många av fördelarna med B-celler, eftersom de kan renas från mjälte eller lymfkörtlar, och har ett högt mitotiskt index när de stimuleras genom odling i medium innehållande lämpliga mitogener 8. Embryonala stamceller (ES-celler) lämpar sig även för metafas kromosomanalys 9. Om dessa inte är tillgängliga, kan fibroblastceller an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH bidrag R00 CA160574 (SFB) och av en gemenskap av Rutgers Biotechnology Training Program (till SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
